【原】我被傻白甜撞了一下腰~

解螺旋 2020-08-27

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作者：Lucky King（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

这次文章的题目是“细胞极性蛋白Scrib——肝癌肿瘤抑制因子”（回复170517可下载）

朕关注的公众号，出现了不少关于这篇文章的科普版简报。好奇咯，所以这期就深入地来看看这篇热文的实验与思路，别人看热闹，咱要看门道。Oncotarget影响因子5分，不算高。但作者单位，看着拽拽的~

Scrib是膜蛋白，涉及维持上皮组织顶端细胞极性，已知参与其他癌症。在哺乳动物中，细胞极性至少由3个蛋白质结构域（Scrib、Crumbs & Par）组成和维持。顶端（Crumbs & Par）和基底外侧（Scrib）的结构域互相拮抗以调节细胞的各种极化过程：如顶基极性、平面细胞极性、不对称细胞分裂和迁移等。当然还有参与其他过程，不赘述。

来，上图~

免疫荧光(IF)观察人肝癌样本中Scrib，发现结构良好，主要位于肝脏非肿瘤区域的细胞膜上（Fig.1A），蓝色为DAPI细胞核，绿色荧光为Scrib；

While，人类肝脏肿瘤细胞（HCC）样本中Scrib高度无组织性、没有明确定位（Fig.1B），Scrib被转移到细胞质中，似乎也存在于细胞核中；

绿色荧光非常强烈，DAPI相对弱，图像合并后几乎观察不到蓝色，红色箭头指向一些DAPI染色的细胞核（Fig.1C）；

免疫组织化学法（IHC）进一步确定肝癌和非肿瘤肝脏之间的Scrib表达水平和定位，与非肿瘤区域（NT）相比，肿瘤区域（T）中检测到更多的Scrib染色（Fig.1D）；

IHC染色还显示了人肝脏肿瘤组织细胞质和核腔中Scrib表达(Fig.1E-H)；

临床样本后，进行动物实验。使用二乙基亚硝胺(DEN)诱导C57BL/6J野生型雄性小鼠中肝肿瘤，并进行Scrib的IF和IHC染色。

与人类样本类似，正常肝细胞中Scrib主要存在于膜上并且结构良好，而在肝脏肿瘤中Scrib定位在细胞质和细胞核中（Fig.2A-B）；

IHC进一步证实，正常小鼠肝脏中，Scrib在细胞膜表达强烈（Fig.2C）；与非肿瘤区域（NT）相比，肿瘤区域（T）中检测到更多更强的Scrib染色（Fig.2D）；肿瘤细胞中，清楚地检测到Scrib扩散到细胞质和细胞核中（Fig.2E）；

Western印迹检测，与非肿瘤组织相比，肝肿瘤中Scrib蛋白表达水平升高（Fig.2F）。

结果综合表明：Scrib在肝肿瘤中表达增加，并且当肝细胞癌变时，Scrib蛋白定位发生了改变，转移到细胞质&细胞核。

在活化增殖的肝癌细胞（HCC）中，Scrib定位在细胞核

在正常肝脏中，90％以上的细胞是静止的，Scrib定位在细胞膜（Fig.1A,2A,2C）。在肝肿瘤中，大部分细胞处于活跃的增殖状态，Scrib被转移到细胞质和细胞核（Fig.1E-F,2E）。

因此，作者猜想：当细胞处于主动增殖状态时，Scrib会发生定位改变，转移到细胞质和细胞核。

培养HCC细胞系（Hepa1-6，HepG2和Huh-7），通过IF和Western印迹进行验证。

WB显示：HCC细胞系（Hepa1-6、HepG2、Huh-7）和肾上皮细胞系HEK293强烈表达Scrib，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中Scrib表达相对较低（Fig.3A）；

免疫荧光(IF)染色，在HepG2，Huh-7和Hepa1-6细胞中，Scrib存在于细胞质和细胞核中（Fig.3B-D）；

从培养的Huh-7和Hepa1-6细胞提取细胞膜、细胞质和细胞核蛋白，在3组成分中都检测到了Scrib（Fig.3E-F），表明：在活跃的增殖细胞中，Scrib不仅转移到细胞质，而且也转移到细胞核。

为了评估Scrib易位主要发生在细胞周期中的S期还是G2/M期，分别使用nocadazole和hydroxyurea阻断G2/M和G1/S周期（Fig.4A-B），流式细胞仪证明周期停滞；

使用nocadazole和hydroxyurea处理24小时后提蛋白做WB，Hepa1-6和Huh-7表现出一致结果，细胞核中的Scrib表达水平高于细胞质和膜(Fig.4C-D)，表明Scrib的定位与特定的细胞周期无关。

接着，功能试验，超表达或者缺失~

Scrib过表达（Scrib-OE）抑制HCC细胞体外生长，抑制异种移植瘤生长

Hepa1-6和Huh-7中过表达Scrib（Fig.5A-B）；

Scrib过表达后，细胞增殖显著减少（Fig.5C-D）；

集落形成试验，表明Scrib过表达会损害集落形成(Fig.5E-H)；

表明Scrib的表达增加具有抑制HCC细胞生长对的作用。

为了进一步确定Scrib-OE对HCC细胞生长的影响，对无胸腺裸鼠进行皮下异种移植。

Scrib超表达组，异种移植肿瘤生长显著降低（Fig.5I-K）；

这些结果表明：当Scrib表达增加时，具有生长抑制作用；Scrib在HCC细胞中起着抑制肿瘤作用。

超表达完，就是缺失/敲除。。。。。

肝脏特异性Scrib缺陷型小鼠经DEN诱导，肝肿瘤发生增强

小鼠模型，特异性地删除Scrib（Fig.6A）；小鼠敲除Scrib后没有任何自发性的发育不良、结节、肝肿瘤。（可做模型用）

DEN化学诱导肝癌模型，分析显示小鼠之间肝脏肿瘤的平均数没有显着变化（Fig.6B-D）；

然而，进一步分析显示与对照小鼠相比，Scrib^fl/fl-Alb^Cre小鼠的较小肿瘤（<2mm）数量减少，较大肿瘤数量增加（> 5 mm）（Fig.6E），表明肝肿瘤生长在没有Scrib的情况下显着增加。

与肝肿瘤生长增加一致，肝脏重量和肝脏/体重比例也在Scrib^fl/fl-Alb^Cre小鼠中显著增加（Fig.6F-H）;

组织学分析：与正常Scrib^fl/fl对比，Scrib^fl/fl-Alb^Cre（Scrib敲除）组显示肝脏肿瘤细胞增大核染色加深、生长紧凑（Fig.6I）；脂肪堆积增加（Fig.6J）；纤维化增加（Fig.6K）；

PCNA染色显示，Scrib^fl/fl-Alb^Cre肝脏肿瘤增殖（Fig.6L-M），但没有检测到对凋亡影响（Fig.6N-O）；

表明Scrib^fl/fl-Alb^Cre小鼠肿瘤生长增加是由于增殖而不是细胞凋亡引起的。这些结果表明，Scrib缺乏加速了肝肿瘤的生长，因此Scrib作为肝癌中的肿瘤抑制因子起作用。

深入分子机制

Scrib-OE使ERK激活受损、下调Yap1、c-Myc和 cyclinD1

转染Scrib -OE的Huh-7和Hepa1-6细胞中，ERK活化受损，Yap1、c-Myc和cyclinD1下调（Fig.7A-B，☀为下调）；

然而，其他癌基因和肿瘤抑制因子的表达或者活性状态没有显著改变（Fig.7A-D）；

那就挑有变化的往下做咯~

敲除Scrib的情况下这些基因是什么情况？

收集对照小鼠和模型小鼠肝脏肿瘤，跑Western：与正常Scribfl/fl肝肿瘤组织对比，Scribfl/fl- AlbCre（Scrib敲除）组增强YAP1、c-Myc和cyclinD1的表达（Fig.7E）。

The data show：Scrib通过抑制ERK的激活和下调Yap1、c-Myc和cyclinD1来抑制HCC细胞增殖和肝肿瘤生长。

通路~

作者首先想是不是通过MAPK通路，调节ERK活性，然鹅，对照和Scrib-OE细胞在Raf1、b-Raf、MEK1/2的表达上没有任何显著差异（Fig.8A-B），说明新司机Scrib没开老路，这就更加值得去研究走了哪条新路。

看看新司机Scrib是否直接撩ERK，并抑制其磷酸化：免疫共沉淀（Co-IP）检测到Hepa1-6细胞中ERK和Scrib之间存在直接相互作用（Fig.8C）；

在0.1%血清饥饿和10%血清刺激的野生型MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞中分别进行Scrib/ERK Co-IP。10%血清刺激下Scrib表达增加（Fig.8D）；

与0.1%血清饥饿条件相比，10%血清刺激后Scrib和ERK之间的相互作用显著增加（Fig.8E）；

使用MEF代替HCC细胞进行血清饥饿和刺激实验，因为癌细胞是相对独立的有丝分裂原，不会因为血清饥饿而保持静止状态。

研究结果表明：有丝分裂途径激活ERK，Scrib通过直接结合ERK来控制ERK的磷酸化。

下面要验证是否通过ERK下调Yap1、cMyc和cyclinD1。

因此，使用MEK抑制剂U0126处理Hepa1-6和Huh-7细胞，检测到降低了ERK的活化，下调了c-Myc和cyclinD1（Fig.8F-G）；

然而，Yap1表达、磷酸化、核定位均不受ERK抑制的影响（Fig.8F-I）。

表明：ERK在Scrib下游起作用，并调节c-Myc和cyclinD1；而Scrib介导的Yap1抑制不是通过ERK途径。

寻找调节Yap1的途径

找了个已知调节Yap1的途径——Hippo pathway，来检测是否走的这条道儿。需要通路中的核心蛋白MST、LATS、MOB1、SAV1等。

Scrib-OE组中，检测到LATS1（S909）的激活态磷酸化增加，并且增加了Yap1的磷酸化，从而引起Yap1随后的降解（Fig.9A-B）；

与这结果相一致的是，Scrib-OE细胞中的核Yap1 减少；Hippo pathway途径中的另一种核转录因子TAZ不受影响（Fig.9C）;

表明：Scrib主要控制HCC细胞中Yap1的磷酸化和降解。

通过放线菌酮追踪蛋白稳定性测定法（cycloheximide chase protein stability assay，没做过没见过，朕下去也要再查查），检测Scrib+/+和Scrib-/-MEFs中Yap1蛋白稳定性。Scrib-/-细胞中Yap1稳定性增加，cyclin D1的稳定性不变（Fig.9D）；

结果综合表明：Scrib通过调节LATS1磷酸化来控制Yap1的稳定性。

Scrib通过ERK和Hippo信号通路抑制Yap1，c-Myc和cyclinD1抑制HCC细胞增殖和肝肿瘤生长。由于Scrib调节了两个单独的途径，这两个途径之间是否存在串扰？

用shRNA敲除YAP1，导致HCC细胞中c-Myc和cyclinD1下调（Fig.9E）；

过表达YAP1后， HCC细胞中c-Myc和cyclinD1的表达增加(Fig.9F)；

表明Yap1调节HCC细胞中c-Myc和cyclinD1的表达。

在HCC细胞中过表达c-Myc，检测到Yap1和cyclinD1的表达增加（Fig.9G）；

说明Yap1和c-Myc之间存在正反馈回路。

为了进一步研究c-Myc是否是Scrib的最终下游靶点，对一些已知的c-Myc靶基因如Glut1、Enolase1、LDH的表达水平进行检测，在Scrib-OE细胞中明显下调（Fig.9H）；

结果表明：MAPK/ERK和Hippo/Yap1途径之间存在串扰；Scrib抑制ERK，促进Yap1降解。

整个文章的故事路线见（Fig.I）。