地高辛标记核酸探针的标记方法

核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
　　近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
        地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。

                               

         采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
        对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
1 　地高辛标记核酸探针的主要标记方法
1. 1 　DNA 探针的标记方法
1. 1. 1 　PCR 掺入法 　

        这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。
1. 1. 2 　随机引物法 　

         用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。 100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
1. 1. 3 　切口平移法 　

        切口平移法DNA 探针技术快速简便，且已非常成熟。先用适量的DNase I 在双链DNA 上打开若干个单链缺口，然后在E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 外切活性和聚合活性的共同作用下，在缺口的5' 端切除单链DNA 序列，随之由新合成的带有地高辛标记的脱氧核苷酸链取代。

        本法适用于环形DNA 或大于1kb DNA 片段的标记。用于原位杂交的核酸探针，通过切口平移法标记最为有效。因为此方法可通过控制DNase I 的酶活性得到适当的缺口，从而得到长度大小适宜的探针，而探针的大小是原位杂交的一个重要参数，足够小的探针才可能穿透组织或细胞。
1. 2 　寡核苷酸探针的标记方法
        合成的寡核苷酸探针被广泛应用于筛选基因文库、Southern 印迹、Northern印迹、斑点印迹及原位杂交试验。地高辛标记寡核苷酸有三种方法:3' 末端标记、5' 末端标记以及在探针3' 端加上数个DIG-11-dUTP 分子的尾巴(图2) 。

                      

1. 2. 1 　3' 末端标记法 　

        3' 末端标记法的主要特点是在每个合成的寡核苷酸(长度为14～100bp) 的3' 末端只添加一个地高辛残基(DIG-ddU TP)。用此方法标记寡核苷酸时,除末端转移酶外,无需其它特别的寡核苷酸合成试剂,方便快捷。所合成的探针适合于要求探针具有较高的特异性而灵敏度一般的试验,如Southern 印迹、Northern 印迹、斑点印迹及菌落P噬菌斑杂交实验。
1. 2. 2 　5' 末端标记法 　

         5' 末端标记法是通过化学方法将地高辛标记于寡核苷酸的5' 末端。首先在5' 末端连接上一个氨基连接臂残基,将合成的寡核苷酸纯化后,再使DIG-NHS 与5' 末端的氨基残基发生共价结合,从而形成标记探针。这类探针的一个主要优点是其3' 端在DNA 合成反应中充当引物,使反应产物得以标记。
1. 2. 3 　3' 末端加尾法 　

        3' 末端加尾法是由末端转移酶在探针3' 末端加上数个地高辛残基的尾巴。此方法标记的探针灵敏度较3' 末端标记法要高出10 倍左右,但由于存在长尾巴,往往会出现较严重的非特异性背景。
1. 3 　RNA 探针的标记方法
        通过RNA 聚合酶SP6 、T7 或T3 经体外转录可将地高辛标记于RNA 探针上。用地高辛标记的RNA 探针具有很强的信号能力,且非特异性背景少,在Southern 印迹和Northern 印迹实验中,效果明显优于同为地高辛标记的DNA 探针,可与放射性同位素标记探针相媲美。另外,在筛选菌落P噬菌斑及原位杂交的实验中,RNA 探针也同样具有良好的效果。而且,由于DIG与UTP之间的键合对碱性不敏感,可通过碱处理方法得到所需大小的探针。

2 　影响探针标记方法选择的因素
         使用地高辛系统时,可根据地高辛系统的不同用途、所获得的用以制备探针的模板类型、以及探针可达到的灵敏度,选择探针标记方法。总体而言,DNA 模板的纯度越高,标记的效率也越高。在进行标记前,应使用苯酚、氯仿抽提DNA 模板。此外,对于随机引物标记DNA 的方法而言,在标记反应之前,先将模板线性化并加热变性是至关重要的;而对寡核苷酸来说,在其3' 末端加上DIG-11-dUTP 的尾巴前,应该先经过凝胶或HPLC 纯化。
3 　杂交技术
        使用地高辛标记的核酸探针进行分子杂交,其杂交动力学、杂交条件与放射性同位素标记的探针相似。探针的性质不同,杂交温度和时间也不同:DNAP不含甲酰胺:杂交温度为68 ℃,时间≥6h ;DNAP含50 %甲酰胺:杂交温度为42 ℃,时间≥6h ;寡核苷酸P不含甲酰胺:杂交温度为54 ℃,时间1～6h ;RNA - RNA 杂交(RNA 探针) :杂交温度为68 ℃,时间≥6h ;RNA - DNA杂交(DNA 探针) :杂交温度为50 ℃,时间≥6h 。
        地高辛标记探针的一个最重要的优点就是稳定性很强。分子杂交后,杂交液中仍旧含有大量没有退火的地高辛标记探针,只要将这些剩余溶液倒回塑料试管中,分别在- 20 ℃(DNA探针) 和- 70 ℃(RNA 探针) 妥善储存,其稳定性至少可以保持一年之久。在使用这些探针时只需解冻后加热至95 ℃,变性10min 即可。如果杂交液中含有甲酰胺,则需68 ℃变性10min。
       此外,在杂交这一环节中,为了避免探针浓度过高而产生干扰背景,有必要在正式杂交前先进行一次模拟杂交,以筛选最适的浓度。
4 　地高辛标记探针的显色检测
4. 1 　化学发光检测
        化学发光检测能通过X 光片记录下很轻微的信号,其检测过程分四个步骤完成。首先使用封闭剂对杂交后的膜进行处理,以阻止抗体对膜的特异性吸引,然后加入结合有碱性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗体(Anti-DIG-AP) ,形成酶联抗体- 半抗原复合物,再加入化学发光底物CSPD 或CDP-StarTM(Boehringer Mannheim 公司的产品) ,使其与膜上的杂交探针所结合的抗体复合物充分反应,最后在X 光片上曝光,以记录化学发光信号。化学发光检测在尼龙膜上的效果优于在纤维素膜上的效果。
4. 2 　化学显色
         化学显色同化学发光检测的显色原理相同，都是通过类似ELISA 实验的程序加以检测，不同的是化学显色加入的显色底物是5-溴-4-氯-3 吲哚酚磷酸盐(也称X-磷酸盐，BCIP) 和氮蓝四唑盐(NBT)，它与酶联抗体- 半抗原(DIG) 复合物在酶促作用下发生反应，于数分钟内开始呈现蓝紫色，随时间延长，颜色逐渐变深，通常于24h 终止反应。

(责任编辑：大汉昆仑王)