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第一篇 细胞学 细胞生物学是研究细胞的结构、功能、生活史以及生命活动本质和规律的科学，是生物科学的主要分支之一，也是生命科学和分子生物学研究的基础。本章包括细胞的化学成分，细胞器，细胞代谢，DNA、RNA和蛋白质的生物合成，有丝分裂和减数分裂，细胞工程等部分。 第三章 细胞代谢  第五节 核酸代谢 （一）、一般性质 1．溶解度 DNA和RNA均微溶于水，它们的钠盐在水中的溶解度较大．DNA和RNA均能溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，所以在分离核酸时，加入乙醇即可使之从溶液中沉淀出来。 2．分子大小、形状和粘度 大多数DNA为线形分子，分子极不对称，其长度可以达到几个厘米，而分子的直径只有2nm。因此DNA溶液的粘度极高。RNA溶液的粘度要小得多。 3．沉降特性 溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。不同构象的核酸（线形、开环、超螺旋结构），蛋白质及其他杂质，在超离心机的强大引力场中，沉降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。 用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时，效果较好。RNA分离常用蔗糖梯度。分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。氯化铯在水中有很大溶解度，可以制成浓度很高（80mol／L）的溶液。 应用啡淀嗅红一氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。如果应用垂直转头，每分钟65 000r（Beckman L-70超离心机），只要6h就可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为每分钟45 000r时，则需36h。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（如图4-10）。蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除去CsCl，再用苯酚抽提1～2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。这样得到的DNA有很高的纯度，可供DNA重组、测定序列及限制酶图谱等之用。在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。 图4-10 经染料氯化铯密度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布 （二）、凝胶电泳 凝胶电泳可算是当前核酸研究中最常用的方法了。它有简单、快速、灵敏、成本低等优点。常用的凝胶电泳有琼脂糖（agarose）凝胶电泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳。凝胶电泳可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率很高。 1．琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物，电泳的迁移率决定于以下因素： （1）核酸分子大小 迁移率与分子量对数成反比； （2）胶浓度 迁移率与胶浓度成反比，常用1％的胶分离DNA； （3）DNA的构象 一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快，线形DNA其次，开环形最慢。但在胶中加入过多的啡啶溴红时，上述分布次序会发生改变； （4）电流 一般不大于5V/cm。有适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比； （5）碱基组成 有一定影响，但影响不大； （6）温度 4～30℃都可，常为室温。 琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，因此用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等。图4-10为分离后DNA与各种杂质的分布。 电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色（0.5μg／ml）。啡啶溴红为一扁平分子，很易插入DNA的碱基对之间。DNA与啡啶溴红结合后，经紫外光照射，可发射出红—橙色可见荧光。0.1μgDNA即可用此法检出，所以此法十分灵敏。根据荧光强度可以大体判断DNA样品的浓度。若在同一胶上加一已知其浓度的DNA作参考，则所测得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来，作进一步分析与长期保留之用。 应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。实用的方法是在同一胶上加一已知相对分子质量的样品（如图4-11中的λDNA／HindIII的片段）。电泳完毕后，经啡啶溴红染色、照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准作品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。最常用的方法是将胶上某一区带在紫外光照射下切割下来，将切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水平电泳槽中进行电泳，让胶上的DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳3～4h后，将电极倒转，再通电30～60s，粘在壁上的DNA重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液（丢弃胶条），用苯酚抽提1～2次，水相用乙醇沉淀。这样回收的DNA纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、序列分析或作末端标记。回收率在50％以上。 2．聚丙烯酸胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。单体丙烯酰胺在加入交联剂后就成了聚丙烯酰胺。由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶的要小，所以可用于分析小于1000bp的DNA片段。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低的核酸样品用此法检测不出来。 （三）、核酸的紫外吸收 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290 nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260 nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定少量的DNA或RNA。检验待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260 nm与280 nm的OD值，从OD260／OD280的值即可判断样品的比纯度。纯DNA的OD260／OD280应为1.8，纯RNA的应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，OD260／OD280的值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定时测定。对于纯的样品，只要读出260nm的OD值即可算出含量。通常按1OD值相当于50μg／ml 双螺旋DNA，或40μg／ml单螺旋DNA（或RNA），或2μg／ml寡核苷酸计算。这个方法既快速又准 确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色而粗略地估计其含量。图4-12为DNA的紫外吸收光谱。 图4-12 DNA的紫外吸收光谱 1.天然DNA；2.变性DNA；3.核苷酸总吸收 （四）、核酸的变性、复性和分子杂交 1、核酸的变性、复性 高温、酸、碱以及某些变性剂（如尿素）能破坏核酸中的氢键，使之断裂，核酸中的双螺旋区变成单链，并不涉及共价键的断裂，这一过程称为核酸的变性。 当将DNA的稀盐溶液加热到80～l00℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，形成无规线团（如图4-13）, 一系列理化性质也随之发生改变：260 nm区紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高，同时改变二级结构，有时可以失去部分或全部生物活性。DNA的变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 图4-13 DNA的变性过程 通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度（meltingtemperature），用Tm表示。DNA的Tm值一般在70～85℃之间。如图4-14。 DNA的Tm值大小与下列因素有关： （１）DNA的均一性 均一性愈高的样品，熔解过程愈是发生在一个很小的温度范围内。 （２）G—C之含量 G—C含量越高，Tm值越高，成正比关系，如图4-15。这是G—C对比A—-T对更为稳定的缘故。所以测定Tm值可推算出G—C对的含量。其经验公式为： G—C（％）＝（Tm－69.3）×2.44 （３）介质中的离子强度一般说来，在离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围也较窄。而在较高的离子强度的介质中，情况则相反。所以DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液中或溶液中，故常在1 mol／L的NaCl中保存。 RNA分子中有局部的双螺旋区，所以RNA也可发生变性，但Tm值较低，变性曲线也不那么陡。 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，许多物理化学性质又得到恢复，生物活性也可以得到部分恢复。 将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性，若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和分子遗传学的研究中应用极广，许多重大的分子遗传学问题都是用分子杂交来解决的。 核酸杂交可以在液相或固相上进行。目前实验室中应用最广的是用硝酸纤维素膜作支持物进行的杂交。英国的分子生物学家E. M .Southern所发明的Southern印迹法（Sonthern blotting）就是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后，再进行杂交的。这里以DNA-DNA杂交为例，较详细地介绍Southern印迹法。将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将胶浸泡在碱（NaOH）中使DNA进行变性，然后将变性DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA！），在80℃烤4～6h，使DNA牢固地吸在纤维素膜上。然后与放射性同位素标记的变性后的DNA，探针进行杂交。杂交须在较高的盐浓度及适当的温度（一般为68℃）下进行数小时或十余小时，然后通过洗涤除去未杂交上的标记物。将纤维素膜烘干后进行放射自显影。 除了DNA外，RNA也可用作探针（Probe）。用32P标记核酸时（用作探针），可以在3′或 5′末端标记，也可采用均匀标记。 应用类似的方法也可分析RNA，即将RNA变性后转移到纤维素膜上再进行杂交。这种方法称为Northern印迹法（Northern blotting）。用类似的方法，根据抗体与抗原可以结合的原理，也可以分析蛋白质。这个方法称为Western印迹法（Western blotting）。 应用核酸杂交技术，可以将含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来。 （五）、核酸的分离 1． RNA的分离 RNA的分离方法因材料及所要分离的RNA种类而异。目前最普遍使用的是酚提取法。将组织匀浆用苯酚处理并离心，RNA即溶解于上层被苯酚饱和的水层中，而DNA和已被凝固的蛋白质分布在下层为水饱和的苯酚中。将上清液吸出，加入乙醇，RNA即呈白色絮状沉淀析出。 2．DNA的分离 DNA的提取法也有多种。目前一般是根据DNA核蛋白能溶于水及高浓度(1～2 mol／L)NaCl溶液，而难溶于0.14 mol／L的 NaCl，RNA核蛋白则易溶于0.14 mol／L的NaCl溶液这一原理进行分离。可先用0.14 mol／L的NaCl溶液除去组织中的RNA核蛋白，然后用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）处理，使DNA与蛋白质分离，并用浓（1 mol／L）NaCl溶液溶解DNA，再用氯仿—异戊醇将蛋白质沉淀除去，最后向DNA溶液中加入乙醇，DNA即呈丝状物沉淀析出。
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