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5.1 基因工程和细胞工程 知识体系 核心提炼
(1)直接分离： 从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。 (2)人工合成目的基因(常用方法如下) ①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。 ②人工合成法：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。 (3)利用PCR技术扩增。 (1)基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。 (2)启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录；终止子是终止转录的位点。 (3)基因表达载体的构建过程
(1)导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针) (2)表达检测 (3)个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。 (1)幼嫩的组织脱分化较为容易，如茎尖、根尖、形成层细胞易脱分化，而植物的茎、叶和成熟的组织则较难。 (2)脱分化形成愈伤组织的过程不需要光，再分化过程需要光，因为愈伤组织利用有机营养成分，而试管苗需要进行光合作用以自养。 (3)利用植物组织培养技术生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。 (4)人工种子发育初期需要的营养物质由人工胚乳提供。 (5)植物组织培养和动物细胞培养过程都存在细胞的培养过程，但植物细胞可以先分裂再分化，而动物细胞不分化只分裂。 (1)杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去掉细胞壁之后形成的原生质体融合，融合的原生质体出现细胞壁之后形成的细胞叫杂种细胞。 (2)重组细胞：体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。 (3)杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。 关注植物体细胞杂交与动物细胞融合的4个易错点 (1)植物体细胞杂交与动物细胞融合中酶的作用对象不同，纤维素酶和果胶酶作用于细胞壁，而胰蛋白酶等作用于细胞间的蛋白质。 (2)灭活的病毒保持了其抗原性，但毒性消失。 (3)植物杂交细胞在激素诱导下能表达出全能性，但动物杂交细胞的全能性不能表达。 (4)克隆动物的起点是经过核移植后形成的重组细胞，其遗传物质主要来自供体，因此形成的个体性状主要同供体，但也有部分性状同受体。 (1)误区一：试管动物与克隆动物的产生都是无性生殖。 纠正：试管动物的产生是有性生殖，克隆动物的产生是无性生殖。 (2)误区二：试管动物(哺乳类)的产生是在体外进行的，克隆动物(哺乳类)的产生是在体内进行的。 纠正：试管动物(哺乳类)和克隆动物(哺乳类)早期胚胎之前都是在体外进行的，早期胚胎经过胚胎移植之后是在体内进行的。 (3)误区三：胚胎移植的优势是充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，因此胚胎移植的胚胎只能来自体内受精的胚胎。 纠正：胚胎移植的胚胎有三个来源：体内正常受精产生的胚胎、核移植产生的重组细胞培养而来的胚胎、体外受精产生的早期胚胎。 真题回放 1.（2016江苏卷.33）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题： （1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用______两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过__________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于__________________态的大肠杆菌。 （2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_____________。 （3）若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ，对于该部位，这两种酶 （填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。 （4）若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得 种大小不同的DNA片段。 【答案】 （1）BclⅠ和HindⅢ 连接 感受 （2）四环素 引物甲和引物丙 （3）都不能 （4）7 【解析】 (1)根据图中质粒和目的基因的特点，质粒中四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，至少要保留一个标记基因，所以不可以选用BamHⅠ酶或Sau3AⅠ酶(BamHⅠ酶和BclⅠ酶识别的序列也可以被Sau3AⅠ酶识别并切割)，否则会破坏两个标记基因，再结合目的基因的结构特点，构建重组质粒时应选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割；酶切后的载体和目的基因片段所形成的缺口，通过DNA连接酶作用后可以进行连接，获得重组质粒。为了扩增重组质粒，可以用大肠杆菌作为受体细胞，此时大肠杆菌需处于感受态，容易吸收周围环境中的DNA分子。 (2)用上述限制酶切割了DNA分子后，只能以四环素抗性基因作为标记基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。用PCR技术扩增目的基因时，根据图2中引物的特点和延伸的方向可知，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙。 (3)根据图中BamH Ⅰ酶和Bcl Ⅰ酶识别的序列特点和切割位点可知，若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端相互连接后，连接部位的6个碱基对序列为： 或 ；对于该部位，图中BamHⅠ酶和BclⅠ酶都无法识别并切割，所以这两种酶都不能切开。 (4)若用Sau3AⅠ切图1质粒，根据Sau3AⅠ识别的特点，可以在质粒的BamHⅠ酶和BclⅠ酶所在的三个位点随机切割DNA分子，若只切割图中任何1个切口，就会形成1种大小的DNA分子；若只切割图中任何2个切口，就会形成6种大小不同的DNA分子；若同时切割图中3个切口，所形成的3种DNA分子片段与只切割图中任何2个切口中的3种DNA片段大小相同，所以最多可能获得7种大小不同的DNA片段。 2.（2016课标1卷.40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： （1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 （2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_____________的固体培养基。 （3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________。 【答案】 （1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可） （2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 （3）受体细胞 【解析】 (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的条件：必须有一个或多个限制酶的酶切位点；必须有自我复制的能力；具有标记基因；必须是安全的，不会对受体细胞造成伤害；分子大小合适，答任意两点都可以。 (2)未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌由于二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的培养基上均不生长，所以二者不能区分；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)的大肠杆菌由于二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长，所以二者不能区分。若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，由于质粒载体使用了BamHⅠ酶切后，破坏的是四环素抗性基因，使细胞失去了四环素抗性，而质粒载体上的四环素(抗性)基因功能完好，因此含有质粒载体的细胞可以在含四环素的培养基上生长，而含有插入了目的基因的重组质粒的细胞不能在含四环素的培养基上生长，所以还需使用含有四环素的固体培养基。 (3)基因工程中，某些改造后的噬菌体作为载体，由于噬菌体属于病毒，没有细胞结构，只有蛋白质和核酸，只能营寄生生活，所以病毒DNA的复制原料来自受体细胞(大肠杆菌)。 3.（2016新课标Ⅲ卷.40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR I、Sau3A I的切点是唯一的）。  根据基因工程的有关知识，回答下列问题： （1）经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。 （2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是____________。 （3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。 【答案】 （1）Sau3AⅠ 两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端 （2）甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录 （3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶 【解析】 (1)HⅠ酶和Sau3AⅠ酶的识别序列中都包括了，且在同一位点将磷酸二酯键断裂，从而形成相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下可彼此连接。(2)完整的基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因，其中启动子和终止子起转录调控作用，必须分布于目的基因的上游和下游。(3)DNA连接酶根据来源不同可分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coli DNA连接酶，另一类是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4 DNA连接酶，E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端，但连接平末端的效率较低。 4.（2016天津卷.7）(12分)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。 （1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。 
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。 A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子 C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子 （3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__________________________。 （4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。 （5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。 【答案】 （1）总RNA （或mRNA）  （2）B （3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化 （4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 （5）HAS 【解析】 (1)为了获取HSA基因，可从人的血液中提取总RNA(或mRNA)逆转录成总cDNA，再以cDNA为模板用PCR技术扩增。引物是一段短的单链RNA或DNA片段，一个引物与含有目的基因一端的一条DNA模板链互补，则另一个引物与含有目的基因另一端的一条DNA模板链互补，方向是相反的。 (2)构建在水稻胚乳细胞内特异性表达rHSA的载体，所选的启动子必须是能够在水稻胚乳细胞内特异性表达的基因的启动子，符合题意的是B。 (3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，添加酚类物质，目的是吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。 (4)途径Ⅰ获取rHSA能通过水稻细胞的膜系统加工，而途径Ⅱ经过大肠杆菌(原核细胞，无生物膜系统)获取，无法对初始rHSA进行加工修饰，所以途径Ⅰ的优势是水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工。 (5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。 6.（2016海南卷.31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题： （1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即______和从_______中分离。 （2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______。 （3）在基因表达载体中，启动子是______聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是______。 （4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_____和______颗粒。 【答案】 （1）人工合成 生物材料 （2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因 （3）RNA 大肠杆菌（或答细菌） （4）金粉 钨粉 【解析】 （1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物质中分离。 （2）植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有的RNA逆转录形成的cDNA文库中含有叶细胞已转录的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。 （3）在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌（或细菌） （4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。 7.（2016上海卷.九）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。 在图27所示的质粒PZHZ11（总长为3.6kb，1kb=1000对碱基因）中，lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。
（1）若先用限制酶BamHI切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1kb质粒的细胞颜色为 ；含3.6kb质粒的细胞颜色为 。 （2）若将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因长度为 kb。 （3）上述4.9kb的重组质粒有两种形式，若用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得 kb和 kb两种DNA片段。 （4）若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于 。 A.人类基因工程 B.动物基因工程 C.植物基因工程 D.微生物基因工程 【答案】 （1）白色 白色和蓝色/白色或蓝色 （2）1.8 （3）1.4 3.5 （4）C 【解析】 （1）3.1 kb质粒lacZ基因被破坏，含3.1 kb质粒的细胞颜色为白色；加DNA连接酶进行连接，被切下的片段可能反向连接，所含3.6 kb质粒的细胞可能含有正常质粒和异常质粒，也可能只含有正常质粒或异常质粒，颜色为白色和蓝色，或者为白色或蓝色。 （2）pZHZ11中0.5 kb的BamHI酶切片段被切除后，剩余3.1kb，将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因插入，形成4.9 kb的重组质粒，则目的基因大小为4.9-3.1=1.8kb。 （3）限制酶BamHI和BglHI切割产生的黏性末端可以进行连接，但连接后不能被两者中的任何一个识别并切割，用BamHI切割4.9 kb的重组质粒，只有一个切割位点。用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7 kb和3.2 kb两种DNA片段；联合酶切同等长度的另一种重组质粒，可获得1.7+1.8=3.5kb和3.2-18=1.4kb两种DNA片段。 （4）题干所述目的是让人的基因在植物细胞中表达，属于植物基因工程。 5.2 胚胎工程、生物技术的安全性和伦理问题、生态工程 知识体系
核心提炼
(1)胚胎移植的4个结论 ①胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换；胚胎移植的优势是充分发挥雌性优良个体的繁殖潜能。 ②胚胎移植过程中两次使用激素，第一次常用孕激素对受、供体进行同期发情处理；第二次用促性腺激素对供体做超数排卵处理。 ③胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母牛是否妊娠进行检查。 ④胚胎移植是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎是由受精卵形成的，还是由核移植技术形成重组细胞并发育而成或胚胎分割形成的。 (2)胚胎分割的2个注意事项 ①材料选择：选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。 ②分割注意点：选材为囊胚时，注意将内细胞团均等分割。 (3)胚胎工程中受精作用的3个关键点 ①受精的标志是在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体。 ②受精完成的标志是雌、雄原核的融合。 ③体外受精时，卵母细胞要培养到减数第二次分裂中期，精子需要获能。
(1)设计试管婴儿比试管婴儿多出的是过程④。 (2)试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。 (3)两者都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
(1)强调物质循环、废物利用、减轻环境污染→物质循环再生原理。 (2)体现物种多，营养关系复杂→生物多样性原理。 (3)强调生物与环境的协调与平衡；涉及环境承载力→协调与平衡原理。 (4)涉及自然、经济和社会；指整个系统，如林业生态工程建设→整体性原理。 (5)涉及结构、功能，分布式、集中式、环式→系统的结构决定功能原理(系统学和工程学原理)。 (6)涉及系统组分的比例关系、总体功能大于各部分之和，指系统内部，如互利共生→系统整体性原理(系统学和工程学原理)。
真题回放 5.（2016课标全国Ⅱ卷.40)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题： （1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_______的方法。②代表的过程是__________。 （2）经过多次传代后，供体细胞中______的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。 （3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是______。 （4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了__________。 【答案】 （1）XX或XY 显微操作（去核法） 胚胎移植 （2）遗传物质 （3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响 （4）已经分化的动物体细胞核具有全能性。 【解析】 (1)核移植技术中，供体可以是雌性也可以是雄性，因此，A的性染色体组成可为XX或XY；去核的方法是显微操作，将早期胚胎移入代孕个体的技术是胚胎移植。 (2)动物细胞传代培养至10～50代时，部分细胞的遗传物质(核型)可能会发生变化，因此，核移植技术中的供体细胞应为传代培养10代以内的细胞。 (3)克隆动物的遗传物质来源于两个个体，其核基因来自于供体，细胞质基因来自于受体(卵母细胞)，细胞质基因也会影响克隆动物的性状。 (4)克隆动物的成功获得证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。
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