Ⅱ型糖尿病肾病大鼠肾动脉与肾内小动脉钙化及BMP2和Runx2的表达*

·论著·

Ⅱ型糖尿病肾病大鼠肾动脉与肾内小动脉钙化及BMP2和Runx2的表达*

陈澄 覃春美 欧三桃 吴蔚桦 魏晓 龚财判 刘琦

(西南医科大学附属医院肾病内科， 四川 泸州 646000)

【摘要】目的 观察Ⅱ型糖尿病肾病(DN)大鼠肾动脉与肾内小动脉钙化以及骨形态发生蛋白2(BMP2)和成骨特异性转录因子2(Runx2)的表达。方法 将24只大鼠随机分为对照组(N组)和Ⅱ型糖尿病肾病组(DN组, STZ加高脂高糖饮食诱导的Ⅱ型DN大鼠模型)，分别于12周，16周处死大鼠。全自动生化分析仪检测大鼠血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、胱抑素C(CysC)及24 h尿蛋白水平。CVon Kossa染色观察肾动脉及肾内小动脉钙盐沉积情况，免疫组化检测肾动脉及肾内小动脉BMP2及Runx2蛋白表达。结果 DN组大鼠各时间点血糖、尿素氮、胱抑素C、肌酐及24小时尿蛋白水平均较N组明显升高(均P<0.05)。 von="">P<>P>0.05)。结论 Ⅱ型糖尿病肾病模型大鼠早期肾动脉即可出现血管钙化，但肾内小动脉无明显钙化，提示糖尿病血管钙化较多发生在大血管，而不易发生在脏器内小动脉。

【关键词】糖尿病肾病； 肾动脉； 肾内小动脉； BMP2； Runx2

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)作为糖尿病的主要并发症之一，已成为我国终末期肾脏病的第二位病因[1-2]。血管钙化是DN患者心血管并发症的主要表现之一，也是DN患者心血管死亡的主要危险因素[3]；糖尿病患者较非糖尿病患者更易发生血管钙化[4]。但目前对糖尿病血管钙化的研究多集中于外周大、中动脉，且多为糖尿病晚期，而对DN肾内小动脉的早期血管钙化情况研究较少。因此，本研究采用高脂高糖联合STZ诱导的Ⅱ型DN大鼠模型，观察肾动脉及肾内小动脉的血管钙化情况及钙化早期标志物BMP2、Runx2的表达。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：清洁级雄性SD大鼠24只，体质量170～220g，购自西南医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(川2013-065)。STZ(Sigma公司)，血糖试纸(美国强生)，生物素化羊抗兔IgG(美国Carlsbad公司)，BMP2多克隆抗体(美国bioworld公司)，Runx2抗体(美国abcam公司)，即用型ABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 Ⅱ型DN模型建立及分组 24只SD雄性大鼠，适应性喂养1周后随机分为对照组(N组，n=12)和糖尿病肾病组(DN组，n=12)。DN组以高糖高脂饲料喂养4周后,予STZ 35 mg/kg一次性腹腔注射，N组以基础饲料喂养，腹腔注射等量枸橼酸盐缓冲液。72小时后测随机血糖，以连续3次血糖≥16.7 mmol/L；24小时尿量大于造模前50%及24小时尿蛋白排泄大于30 mg为DN模型建立成功。实验第12、16周时处死大鼠，留取24小时尿液并心脏取血，用全自动生化分析仪检测大鼠血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、胱抑素C(Cys C)及24 h尿蛋白水平。摘取肾动脉及肾组织标本，固定于4%中性多聚甲醛液，经脱水、透明和包埋，制成石蜡块，其余组织冻存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 Von Kossa染色检测钙盐沉积 取大鼠肾动脉及肾组织石蜡块，制作为4 μm厚的石蜡切片，常规脱蜡、脱水，浸入1%的硝酸银溶液，紫外线照射30分钟(照射过程中不能干液) ，5%硫代硫酸钠液5分钟， 经核固红复染、脱水、透明、封片，行光镜观察钙盐沉积的情况。

1.2.3 免疫组化检测BMP2、Runx2蛋白表达 大鼠肾动脉及肾组织石蜡切片脱蜡至水后，按免疫组化试剂盒的说明，采用ABC法依次行热修复抗原，正常山羊血清封闭非特异抗原，滴加一抗、二抗、ABC复合物、DAB显色液，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片，出现棕黄色颗粒为阳性信号。

1.3 统计学方法 用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差±s)表示,组间的比较采独立样本均数t检验，P<>

2 结果

2.1 两组生化指标比较 DN组大鼠各时间点血糖、BUN、血Scr值、Cys C及24 h尿蛋白水平均较N组显著升高(均P<>

表1 各时间点两组大鼠血糖及肾功能指标变化±s)

Table 1 The level of blood glucose, renal function and 24- h UPro at different time points

生化指标N组12周16周DN组12周16周血糖(mmol/L)8．76±2．507．86±1．4026．48±3．32①26．19±3．57①BUN(mmol/L)5．46±0．795．63±0．477．98±0．82①8．46±1．43①Scr(umol/L)46．00±4．8636．17±3．4968．5±7．18①74．33±12．37①CysC(mg/L)0．32±0．100．21±0．100．58±0．09①0．67±0．11?24h尿蛋白(mg)22．93±2．7221．35±2．72115．36±15．7①124．88±14．27①

注：与N组相比，① P<>

2.2 两组肾动脉钙盐沉积情况 DN组于12周可见肾动脉组织内膜及中膜弹性纤维间黑色颗粒沉积，表明存在钙盐沉积，16周时，黑色颗粒沉积较12周增多，可见团状及条带状黑色颗粒沉积；N组各时间点均未见明显钙盐沉积，见图1。两组肾组织肾内小动脉12、16周时均未见明显钙盐沉积，见图2。

2.3 肾动脉及肾组织BMP2、Runx2蛋白表达 免疫组化结果显示，N组大鼠各时间点可见肾动脉血管中膜平滑肌细胞BMP2、Runx2仅有少量表达,DN组大鼠肾动脉可见BMP2、Runx2蛋白大量表达，且随着时间的延长，其表达逐渐增多(P<>P>0.05)，见图4。

图1 肾动脉Von Kossa 染色情况(×200)

Figure 1 Von Kossa staining of the renal artery

注：A.N组12周，B.N组16周，C.DN组12周，D.DN组16周。

图2 肾内小动脉Von Kossa 染色情况(×200)

Figure 2 Von Kossa staining of the renal tissue

注：A.N组12周,B.N组16周,C.DN组12周,D.DN组16周。

图3 肾动脉不同时间点BMP2、Runx2的表达(×200)

Figure 3 The levels and expression of BMP2, Runx2 protein at different time points in renal artery (×200)

注：BMP2表达A.N组12周，B.N组16周，C.DN组12周，D.DN组16周；Runx2表达，E.N组12周，F.N组16周，G.DN组12周，H.DN组16周。

图4 肾内小动脉不同时间点BMP2、Runx2的表达(×400)

Figure 4 The levels and expression of BMP2 (a) and Runx2 protein (b) at different time points in renal arteriole (×400)

注：BMP2表达A.N组12周，B.N且16周，C.DN组12周，D.DN组16周；Runx2表达,E.N组12周，F.N组16周，G.DN组12周，H.DN组16周。

3 讨论

据国际糖尿病联盟统计，估计到2030年糖尿病人数将增加至5.52亿，其中，48%的增长将发生在中国和印度。糖尿病的发病率呈上升趋势，糖尿病肾病的发病率也随之上升[5]。糖尿病患者发生血管钙化的机率是正常人的4倍[6]。Chiu等[7]证实了糖尿病肾病患者早期无明显临床症状时即可发生较明显的肾动脉钙化，DN患者肾动脉钙化是预测患者发展成为终末期肾病的独立预测因素。

既往认为血管钙化是一个被动、退化的过程，但是现在越来越多的证据表明血管钙化是一个主动的细胞调节过程，类似于骨的矿化，许多与成骨相关的调节因子都参与了血管钙化的过程[8-10]。BMP2为导致血管钙化研究最广泛的骨形态发生蛋白之一，BMP2信号通路是成骨分化过程中的重要调节通路[11]。BMP2与细胞表面的Ⅱ型受体结合后，激活Ⅰ型受体，激活R-Smads，结合Co-Smad形成复合物，然后进入核内结合一些相关转录因子，激活其在核内的靶点Runx2，导致钙化的发生[12]。Runx2具有Runt DNA结合结构域，在前成骨细胞、成骨细胞、前软骨细胞和前肥大软骨细胞中表达，是成骨转化和骨形成过程中必不可少的转录因子[13-14]。Ⅱ型糖尿病患者血浆中BMP2水平较正常对照组明显增高，且与血管钙化相关[15]。Bostr?m等[16]发现高糖状态能够导致Ⅱ型糖尿病大鼠主动脉发生钙化，同时BMP-2, BMP-4,Noggin基质gla蛋白(MGP), 活化素样激酶1(ALK1), ALK2, ALK3, ALK6, BMPRⅡ的表达均明显增加，相应地主动脉中pSMAD1/5/8的水平有所上升，且Runx2及 Osterix的表达也增强。有研究表明，BMP信号途径抑制剂LDN-193189 或 ALK3-Fc能够使MGP-/-小鼠主动脉钙化较对照组减少约80%，且较对照组生存期限延长[17]。本研究用STZ加高脂高糖饮食诱导Ⅱ型DN大鼠模型观察DN肾动脉情况，研究结果显示DN组各时间点血糖及24h尿蛋白水平明显高于正常对照组，造模成功。DN模型大鼠肾动脉组织各时间点Von Kossa染色可见黑色钙盐沉积，而正常大鼠无沉积。与正常对照组相比，DN组大鼠各时间点肾动脉组织中BMP2及Runx2的表达均明显升高，这表明Ⅱ型糖尿病肾病模型大鼠肾动脉早期即可出现血管钙化，且有钙化早期标志物BMP2及Runx2的表达。

糖尿病发生微小血管病变主要累及肾脏、视网膜、心脏等，经过10～20年，部分糖尿病患者可发展成糖尿病肾病，最终发展成为终末期肾病，伴随着大量蛋白尿和肾小球滤过率下降[18]。Hu等[19]在ApoE-/-小鼠中观察主动脉、冠状动脉树动脉粥样硬化(arteriosclerosis，AS)病灶，发现与主动脉相连的冠状动脉主干有AS晚期病灶，冠状动脉主干以下的分支血管(包括心肌内小分支)有早期的AS病灶，他们认为这提示冠状动脉心肌内小分支AS 病灶的形成规律与大、中动脉血管的AS 病灶相似，也即是实质器官内的小动脉也可能会发生早期AS，只是可能其病理改变不典型。钙化的肾动脉其主干分支即肾实质内的小动脉是否也存在钙化或钙化早期相关因子的表达目前还鲜有研究。赵安菊等[20]发现DN模型大鼠于24周时使用茜素红染色可见肾内小动脉轻到中度钙化，且BMP2表达明显增加。本实验结果显示，DN大鼠肾内小动脉上未见明显黑色钙盐沉积，虽有BMP2及Runx2的少量表达，但与正常组对比差异无统计学意义，提示可能糖尿病肾病较早阶段肾内小动脉尚未发生明显钙化。

4 结论

Ⅱ型糖尿病肾病模型大鼠肾动脉早期即可出现血管钙化，但肾内小动脉无明显钙化，提示糖尿病血管钙化仍以发生在肾动脉等大血管为主，而不易发生在脏器内小动脉。阻断BMP2信号通路或许能够为防治糖尿病血管钙化提供新的治疗思路。

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Expression of BMP2 and Runx2 and vascular calcification in renal artery and arteriole of type 2 diabetic Nephropathy rats

CHEN Cheng, QIN Chunmei, OU Santao，WU Weihua,WEI Xiao, GONG Caipan,LIU Qi

(Department of Nephrology，The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan, China)

【Abstract】Objective To observe the calcification and the expression of BMP2，Runx2 in renal artery as well as renal arteriole in type 2 diabetic nephropathy rats. Methods 24 male rats were randomly divided into control group (N group) and diabetic nephropathy group (DN group). Type 2 diabetic nephropathy model was established by high sugar and fat diet and streptozotocin (STZ) injection. Calcium depositing in the renal artery as well as renal arteriole were observed by von Kossa staining. The protein expression of BMP2 and Runx2 were detected with immunohistochemistry. Results Contents of blood glucose, blood urea nitrogen( BUN ), cystatin C (Cys C), Serum creatinine (Scr) and 24 h urinary protein (24 h Upro) of group DN at all time point were much higher than those of group N (P<0.05). black="" granules="" were="" found="" deposited="" in="" the="" renal="" artery="" of="" dn="" rats="" in="" 12="" and="" 16="" weeks="" and="" the="" black="" calcium="" salt="" was="" gradually="" increased="" with="" the="" time="" passing.="" no="" calcium="" salt="" was="" found="" in="" group="" n.="" however,="" no="" calcium="" salt="" was="" found="" in="" group="" n="" and="" group="" dn="" in="" the="" renal="" arteriole.="" the="" protein="" expression="" of="" bmp2="" and="" runx2="" in="" group="" dn="" rats="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" n="" group="" in="" renal="" artery.="" the="" expression="" of="" bmp2="" and="" runx2="" in="" the="" renal="" arteriole="" was="" little,="" which="" had="" no="" statistical="" significance="" from="" that="" of="" the="" normal="" group.="" conclusion="" the="" renal="" artery="" calcification="" may="" appear="" in="" the="" early="" stages="" of="" type="" 2="" diabetic="" nephropathy="" rats="" model,="" while="" there="" is="" no="" obvious="" calcification="" in="" the="" renal="" arteriole.="" it="" indicates="" that="" vascular="" calcification="" is="" more="" occurred="" in="" large="" blood="" vessels="" and="" less="" prone="" to="" occur="" in="" arteriole="" in="" the="">

【Key words】Diabetic nephropathy; Renal artery; Renal arteriole; Bone morphogenetic protein 2; Runt-related transcription factor 2

通讯作者：欧三桃，主任医师，E-mail：[e-mail]

【中图分类号】R 587.2

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.02.002

(收稿日期：2016-10-20；

修回日期：2016-11-22； 编辑： 张文秀)

基金题目：西南医科大学附属医院基金(泸医附院[2013]60号)