人退行性变髓核细胞体外分离培养及鉴定*

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·论著·

人退行性变髓核细胞体外分离培养及鉴定*

罗栩伟　李艳　刘康　冯刚　陈竹

(南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所， 四川 南充 637000)

【摘要】目的　观察体外分离培养的人退行性变髓核细胞形态学表现，并分析其生物学特性。方法　收集人退变髓核组织，胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞行平面培养并传代，倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，并分别在1w、2w、3w三个时间点通过硫酸化的糖胺聚糖含量测定、免疫组化染色、Safranin-O染色、Real-time PCR对髓核细胞进行生物学特性分析及鉴定。结果　髓核细胞呈星形、多角形、梭形，部分胞浆突起，伸出伪足，与软骨样细胞形态相近，传代后细胞形态体积较原代大。髓核细胞能合成大量硫酸化的糖胺聚糖，细胞中富含蛋白多糖、Ⅱ型胶原，免疫染色呈阳性，随着培养周数的增加，其着色深度无明显强化。Safranin-O染色将细胞核染成红色，胞浆淡染，随着培养日期的延长，其红色强度无明显加深。Real-time PCR检测到Aggrecan、CollagenⅡ两基因在1w、2w、3w均持续稳定的表达，各观察点间无统计学差异(P>0.05)。结论　胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法操作简单，培养效率高，传代培养的髓核细胞增殖速度快，经鉴定具有典型的类软骨细胞表征及良好的生物学特性，能持续稳定的表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原。

【关键词】髓核；细胞；培养；生物学特性

髓核(Nucleus pulposus，NP)为半透明胶冻状组织，是椎间盘中心构成部分，它富含蛋白多糖、Ⅱ型胶原及大量水分等细胞外基质成分，具有高弹力及抗张力特性，对维持脊柱稳定及生理弯曲有着极为重要的意义[1-2]。髓核细胞的衰老凋亡、外基质降解、蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量减少、水分丢失等一系列生化改变是椎间盘退行性变(Intervertebral disc degeneration，IDD)发生发展的重要原因[3-5]。基因干预、细胞移植、髓核组织工程构建等是椎间盘退变髓核生物治疗的主要手段[6-7]。因此，为了能更好模拟髓核生物学性能，对髓核细胞生物学特性的研究显得尤为重要。本研究拟通过体外分离培养人退行性变髓核细胞，从多角度观察并分析其类软骨细胞的形态学表型及生物学特性，为进一步拓展椎间盘退行性变髓核生物治疗研究提供一种新的细胞培养模式及详实可靠的细胞形态生物学依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　髓核组织来源　收集的5例退行性变髓核组织，为2015年7～12月期间在南充市中心医院行腰椎间盘突出症经后路椎板开窗髓核摘除术所切除的髓核组织，术前经CT、MRI确诊，术后经病检证实为髓核组织退行性变，Thompson 分级属Ⅳ、Ⅴ级[8]。患者年龄均在45～60岁之间，L4/5 3例，L5/S1 2例。

1.1.2　主要试剂　FBS、DMEM(Hyclon)；0.25%胰酶-EDTA(Invitrogen)；II型胶原酶、牛睾丸透明质酸酶、木瓜蛋白酶、HoeChst 33258、Safranin-O、Fast Green、DMMB(Sigma)；Collagen II免疫组化试剂盒(Chondrex)；Aggrecan抗体(Santa Cruz)；BSA(TaKaRa)；逆转录试剂盒(Fermentas)；iQ SYBR Green(Bio-Rad)；DAB显色液(武汉博士德生物有限公司)。

1.2　实验方法

1.2.1　髓核的分离培养　从手术摘除椎间盘中仔细分离出髓核组织，PBS冲洗3遍，用眼科剪将髓核组织剪碎至1 mm3大小，将组织混合液转入15 mL的离心管中，1 500 rpm离心5min，去上清，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃恒温水浴消化20 min，1 500rpm离心5 min，去上清，加入0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃恒温水浴消化2 h，1 500 rpm离心5 min，去上清，重复Ⅱ型胶原酶消化步骤再次消化离心后，用适量20%FBS的DMEM培养液漂洗，1 500rpm离心5 min，去上清，重复漂洗步骤 3次。最后用20%FBS的DMEM培养液1 mL吹散细胞，计数板进行细胞计数，按2×105/mL接种于75 cm2培养瓶中，用20%FBS的DMEM培养液10 mL重悬，将培养瓶置于含95%空气、5%CO2的37 ℃细胞培养箱中培养，每2～3 d换培养液1次，倒置显微镜逐日观察细胞贴壁及生长情况并拍照，当细胞生长至80%～90%融合后进行传代培养。

1.2.2　髓核细胞生长曲线的测定　取第2代髓核细胞，按细胞密度为4×105/mL接种于6个75 cm2培养瓶中进行培养，分别在接种后的第3、7、10、14、21、28 d， 各取1个培养瓶用胰酶消化后进行细胞计数，算出每mL的细胞数，并绘制细胞生长曲线图。

1.2.3　硫酸化的糖胺聚糖(Sulfated Glycosaminoglycan，sGAG)/DNA测定

1.2.3.1　sGAG含量测定　取第2代髓核细胞，按细胞密度为8×104/mL接种于6孔板，设置1w，2w，3w，3个观察时间点，每组3个孔，用2%FBS的DMEM培养液培养。分别于每个观察点取出1个6孔板，用PBS洗净后每孔加入木瓜蛋白酶2 mL，置于56℃恒温水浴锅中消化24小时。取0.5 mL混合液转移到15 mL离心管，依次加入100 mM碘乙酸0.5 mL、 0.5M Tris-HCl 0.5 mL、50 mM Tris-HCl(PH8.0)3 mL、DMMB显色液2.5 mL，混匀反应15 s，于525 nm处测定吸光度值。配制1～100 μg/mL硫酸软骨素标准液并绘制标准曲线，并根据标准曲线计算样品中sGAG含量。

1.2.3.2　DNA测定　按照Hoechst 33258说明书稀释1 mg/mL小牛胸腺DNA、1 mg/mL Hoechst 33258，并配制1～100 μg/ml标准液，打开荧光分光光度计开关，预热15 min，设置激发波长360 nm，发射波长460 nm，绘制标准曲线。清洗比色杯，加入500 μL经木瓜蛋白酶消化后待测样品和1.5 mL染液，混匀，上机读数记录，根据标准曲线计算出样品中DNA含量。

1.2.4　Aggrecan免疫荧光检测　按1.2.3.1准备细胞，分别于每个观察点取出1个6孔板，PBS洗3次，甲醇固定10 min，PBS洗3次，5%BSA封闭液室温封闭1小时，将一抗用5%BSA封闭液按一定比例稀释后加入到6孔板，1 mL/孔，4℃冰箱孵育过夜；次日复温30 min，去一抗，PBS洗3次，加二抗，置于37 ℃恒温水浴锅孵育1小时，去二抗，PBS洗3次，荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

1.2.5　CollagenⅡ免疫组化检测　按1.2.3.1准备细胞，分别于每个观察点取出1个6孔板，PBS洗3次，用预冷的2.5%戊二醛固定10 min，PBS洗3次，2%牛睾丸透明质酸酶室温封闭30 min，PBS洗3次，加入适量0.1%～1%过氧化氢室温下放置10 min，PBS洗3次，加入Blocking Buffer放置30 min，PBS洗3次，加一抗，按1∶250用Antiboby Dilution液稀释，4 ℃冰箱孵育过夜，次日锅，复温30 min，去一抗，PBS洗3次，添加Streptavidin Peroxidase，按1∶5用Streptavidin Peroxidase Dilution Buffer稀释，室温下孵育1小时，去Streptavidin Peroxidase，PBS洗3次，加入DAB显色液，在显微镜下观察染色结果并拍照。

1.2.6　Safranin-O染色　按1.2.3.1准备细胞，分别于每个观察点取出1个6孔板， ddH2O洗3次，苏木素染色6 min，ddH2O洗10 min，2% Fast Green染色3 min，1%盐酸-酒精脱色5 min，0.1% Safranin-O染色5～10 min，ddH2O洗2次，显微镜下观察染色结果并拍照。

1.2.7　Aggrecan、CollagenⅡmRNA表达情况　按1.2.3.1准备细胞，分别于每个观察点取出1个6孔板，抽提髓核细胞RNA，逆转录为cDNA，反应条件为：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以Human β-action为内参基因，作Real-time PCR扩增并进行分析，引物序列见表1。

1.2.8　统计学分析　本实验所有数据将采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差表示，组间比较用独立样本t检验，以P<>

表1　Aggrecan、Collagen II及内对照β-action基因的引物序列

Table 1　The primers of Aggrecan, Collagen II and β-action

基因基因引物序列Humanβ-actionForward5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'Humanβ-actionReverse5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'AggrecanForward5'-CGCTACTCGCTGACCTTT-3'AggrecanReverse5'-GCTCATAGCCTGCTTCGT-3'CollagenⅡForward5'-TCCCAGAACATCACCTACC-3'CollagenⅡReverse5'-AACCTGCTATTGCCCTCT-3'

2　结果

2.1　髓核细胞生长曲线　传代后的髓核细胞24小时大部分贴壁，生长较原代迅速，7天后进入对数生长期，2～3w铺满瓶壁，3～4w部分细胞生长、增殖停止，少许细胞衰老或死亡，见图1。

2.2　sGAG/DNA　髓核细胞合成大量sGAG，并能持续稳定的表达。虽随培养周数sGAG含量有所增加，但三组间比较差异并无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图1　传代髓核细胞生长曲线

Figure1　Growth curve of the second passage of NP cells

图2　髓核细胞sGAG/DNA

Figure2　Levels of sGAG normalized to DNA content in NP cells

2.3　髓核的培养　退变髓核组织中细胞含量较少，原代消化后，较少细胞贴壁，细胞生长增殖很缓慢。7天后贴壁细胞增多，生长迅速，细胞呈星形、多角形、梭形，部分胞浆突起，并伸出伪足，与软骨样细胞形态相近。10天后部分细胞融合成片，堆积生长，开始进入对数生长期。3～4w铺满瓶壁，进行传代。传代后的髓核细胞形态体积较原代大，贴壁时间短，生长较迅速，余无明显变化，见图3。

2.4　Aggrecan免疫荧光检测　髓核细胞中富含蛋白多糖，三个观察点均能检测到大量蛋白多糖合成，免疫荧光染色均呈阳性，阳性染色主要出现在胞浆内，胞核几乎不着色，随着培养周数的增加，其着色深度无明显强化，见图4。

2.5　CollagenⅡ免疫组化检测　髓核细胞在培养1w、2w、3w均有大量Ⅱ型胶原合成，免疫组化染色呈阳性，胞浆被染成棕黄色，随着培养时间的延长，各个观察点着色深度基本一致，见图5。

2.6　Safranin-O染色　三个时间点髓核细胞蛋白聚糖Safranin-O染色均呈阳性表达，细胞核被染成红色，胞浆淡染，随着培养日期的增加，其红色强度并无明显加深，见图6。

2.7　Aggrecan、CollagenⅡ mRNA表达水平　Real-time PCR检测到Aggrecan、CollagenⅡ基因在1w、2w、3w均能持续稳定的表达，两基因在各观察点表达水平相当，差异无统计学意义(P>0.05)(图7)。

图3　髓核细胞的形态孢子(×100)

Figure3　Morphology of NP cells

注：A、B、C为原代培养髓核细胞，D、E、F为传代培养髓核细胞，A、D为1w，B、E为2w，C、F为3w

图4　髓核细胞免疫荧光染色检测蛋白多糖的表达(×200)

Figure4　Immunofluorescent staining of NP cells for aggrecan

注：A、D为1w，B、E为2w，C、F为3w

3　讨论

椎间盘退行性变疾病为临床常见病和多发病，是引起下腰痛的主要病因。其主要生化改变为蛋白多糖和Ⅱ型胶原生成减少、水分含量丢失、细胞衰老凋亡等呈“瀑布”样反应的细胞外基质降解征象[9-11]。随着现代生物治疗技术的迅速发展和广泛应用，椎间盘退变生物治疗成为了当今众多学者的研究课题，髓核作为椎间盘的中心构件也因此成为了科学研究的热点。有相关研究证实，椎间盘退变的发生发展最先是从髓核的退变开始[5]。髓核为富含髓核细胞、蛋白多糖、Ⅱ型胶原及大量水分的半流体胶冻状组织，它起着弹性缓冲外力的作用，能将所受压力传递至纤维环以及椎骨，从而维持脊柱的稳定性及生理弯曲[12]。髓核细胞本质上是类软骨细胞，它能合成大量的蛋白多糖、Ⅱ型胶原等物质，在维持椎间盘生物学及力学特性方面起着主导作用。基因干预、细胞移植、髓核组织工程构建等作为椎间盘退变髓核生物治疗的主要手段，其研究基础在于充分了解并掌握髓核细胞的形态学特征、生物学特性，才能更好地模拟符合人体生理的髓核生物学性能。

图5　髓核细胞免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达(×200)

Figure5　Immunostaining of NP cells for type-Ⅱ collagen

注：A、D为1w，B、E为2w，C、F为3w

图6　髓核细胞Safranin-O染色检测蛋白聚糖的表达(×200)

Figure6　Safranin-O staining of NP cells for proteoglycan

注：A、D为1w，B、E为2w，C、F为3w

图7　髓核细胞Aggrecan (A)、Collagen Ⅱ (B) mRNA的表达

Figure7　Gene expression patterns in NP cells

注： (A) Aggrecan mRNA levels; (B) Collagen Ⅱ mRNA levels

通常成人的椎间盘髓核细胞主要是由脊索细胞演化而来，属于终末细胞。其增殖能力较弱，体外培养难度较大，对培养条件的要求较高，培养的时间较长。Grubar等用20%FBS培养椎间盘细胞，结果表明髓核细胞约需1个月时间才能从最初组织块中长至P1代[13]。传统组织块培养法，细胞游离出髓核组织块的时间较长，一般为2周，虽然该方法操作简便，但贴壁的细胞较少，培养时间较长；单纯胰酶消化法获得的细胞贴壁时间较短，但由于退变的髓核组织中含有大量的胶原成分，尤其是Ⅱ型胶原，因此消化物中残留大量胶原，会影响细胞的生长，培养的髓核细胞中将含有大量杂细胞，且胰酶消化时间的长短难以准确掌握；单纯用低浓度胶原酶消化可以特异性水解胶原蛋白的超螺旋结构，但此方法消化的时间较长，且获得的髓核细胞较少，若用较高浓度的胶原酶消化耗费较高[11]。本研究综合胰酶和胶原酶消化的方法，获得髓核细胞数量大且纯正，传代培养的细胞增殖速度快，细胞呈星形、多角形、梭形，部分胞浆突起，伸出伪足，与软骨样细胞形态相近。

在髓核细胞生物学特性的研究中，目前尚未明确特异性的标志物[14]，学者们普遍默认将蛋白多糖及Ⅱ型胶原视为髓核细胞的特征性产物进行鉴别。本研究中，我们在传代培养的1w、2w、3w三个时间点利用免疫组化染色、Real-time PCR分别从蛋白水平、基因水平观察到髓核细胞中有大量蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达。此外，sGAG含量的测定常被用于评估细胞内糖胺聚糖水平，本研究中我们将sGAG总量比上细胞总DNA，消除了细胞数不同对测定值的影响，检测到不同时间点sGAG的含量，并进一步通过Safranine-O染色检测到髓核细胞内蛋白聚糖合成情况。因此，本研究从多角度形态学、生物学特性评价证实所培养细胞系人髓核细胞，它能在体外培养体系中持续稳定的表达自身细胞特性，合成大量的蛋白多糖及Ⅱ型胶原。本研究中我们还发现，最初的传代髓核细胞基本保持了原代髓核细胞的生物活性，但随着传代次数的增加，不可避免的出现了细胞纤维化变性，导致细胞生殖、增长、活性大幅度下降。因此，如何提供一个使细胞保持原始形态生物学活性不变的生长环境将是我们下一步研究的课题。

4　结论

本研究采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法成功分离培养出人退行性变髓核细胞，该法操作简单，培养效率高，传代培养的髓核细胞增殖速度快，经鉴定具有典型的类软骨细胞形态学表征和良好的生物学特性，为进一步拓展椎间盘退行性变髓核生物治疗，提供了一种新的细胞培养模式和详实可靠的细胞形态生物学依据。

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Isolation, culture and identification of human degenerative nucleus pulposus cells in vitro

LUO Xuwei, LI Yan, LIU Kang, et al

(Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, Nanchong Central Hospital· The Second Clinical Institute ofNorth Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China)

【Abstract】Objective　To observe the morphological features and analyze the biological characteristics of human degenerative nucleus pulposus (NP) cells isolated in vitro. Methods　NP tissues were separated and collected from human degenerated intervertebral disc samples. After sequential enzymatic digestion of collagen II and trypsin, cells from the NP tissues were isolated and cultured in monolayer. The morphological features and growth of NP cells were observed by an inverted microscope after subculture. The biological characteristics of NP cells was analyzed and identified by the measurement of sulfated glycosaminoglycan (sGAG), Immunohistochemical staining, Safranine-O staining and real-time PCR at three time points. Results　NP cells were star-shaped, polygonal and spindle-shaped, which were similar to the cartilage-like cells. After passage, the cell volume was larger than that of primary generation. We clearly observed that human NP cells can produce a large content of sGAG. Immunostaining of NP cells showed that type-II collagen was stained dark brown, and aggrecan showed red fluorescence. Safranin-O staining created a red appearance in all cell culture lines. The mRNA levels of collagen II and aggrecan were determined in NP cells using real-time PCR performed with the SYBR Green PCR kit. These researches confirmed that no significant effect was observed among each point. Conclusion　The sequential enzymatic digestion of collagen II and trypsin can simplify the isolation process of NP cells which can improve the culture efficiency. We observed that NP cells had a fast multiplication rate, typical exosyndrome of chondrocyte, and satisfactory biological characteristics. The expression of proteoglycans and collagen II were identified by a sustained and steady modality in NP cells.

【Key words】Nucleus pulposus; Cell; Culture; Biological characteristics

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81201407、81171472、81071270、30872614)；四川省杰出青年学科带头人资助计划(09ZQ026-005)；四川省科技支撑计划项目(2010SZ0048)；南充市应用技术研究与开发资金项目(11A0115)；川北医学院科研发展计划重点培育项目(CBY11-A-ZP01)

通讯作者：冯刚，教授，本刊副主编，E-mail: [e-mail]

【中图分类号】Q 813.1

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.004

(收稿日期：2016-04-22； 编辑： 张文秀)