ARHI基因与HuR蛋白在胰腺癌PANC-1细胞中的表达杨 红，胡珊珊，阮戈冲，杨晓鸥，钱家鸣 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京100730 通信作者:钱家鸣 电话:010-69155019，E-mail:qianjiaming1957@126．com 【摘要】目的 观察ARHI基因转染胰腺癌PANC-1细胞后对HuR蛋白的影响。方法 采用脂质体法将表达ARHI基因的质粒pLNCX2-ARHI-EGFP和空载体pLNCX2-EGFP转染胰腺癌PANC-1细胞，细胞分为3组:实验组 (pLNCX2-ARHIEGFP)、空载体转染组 (pLNCX2-EGFP)和PANC-1细胞空白对照组，用G418筛选稳定转染的细胞株;采用PCR和Western blot方法检测ARHI基因表达，采用Western blot方法检测HuR蛋白表达。结果 稳定转染ARHI基因组可检测到ARHI基因mRNA和蛋白的表达。根据图像灰度计算蛋白条带相对表达量，稳定转染ARHI基因组HuR蛋白表达(0.2226±0.0644)较空载体对照转染组 (0.4063±0.0925，P=0.029)和PANC-1细胞空白对照组 (0.4178±0.1319，P=0.022)显著降低。结论 ARHI基因可以导致胰腺癌细胞株中HuR蛋白表达降低。 【关键词】胰腺癌;ARHI基因;HuR ARHI基因是母源性印迹基因，属于Ras超家族成员之一，其编码的蛋白在人类多种正常组织中如卵巢、乳腺和胰腺中表达，但在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中却存在表达下调［1］。本研究组前期研究发现，ARHI基因是胰腺癌重要抑癌基因，可抑制胰腺癌细胞增殖和生长，诱导细胞凋亡和自噬［2］。然而ARHI基因如何调控下游信号未知甚多。近几年来，RNA结合蛋白在细胞功能调控中的作用日益受到人们重视，HuR蛋白是目前研究热点mRNA结合蛋白的一种，可以与多种调控因子如p53和Cyclin A等mRNA相连接，参与各种细胞应答及肿瘤形成等，在肿瘤发生发展机制中起重要作用。 本研究应用基因转染技术，探讨ARHI基因转染后对HuR蛋白表达的影响，从而为进一步了解ARHI基因在胰腺癌中调控功能探讨可能的途径。 材料和方法胰腺癌PANC-1细胞培养 胰腺癌细胞株 PANC-1细胞来源于 ATCC库(American Type Culture Collection)。细胞培养于含10%胎牛血清及双抗 (青霉素100 kU/L，链霉素0.1 g/L)的DMEM高糖培养基 (Invitrogen公司，美国)，置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中，常规进行细胞培养及传代。 质粒转染和G418筛选多克隆稳定转染细胞 取对数生长期细胞接种于6孔板，分为试验组(pLNCX2-ARHI-EGFP)、空载体转染组 (pLNCX2-EGFP)和PANC-1细胞空白对照组，每组3孔。待细胞融合度达到70% ～80%，用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国) 按质粒∶lipo2000为4.0 μg∶10 μl进行转染。 转染48 h后，加入终浓度为0.9 g/L的G418筛选14 d，每天更换培养基及G418，维持筛选压力。第12～14天时，大部分细胞已死亡，继续维持高浓度G418筛选至第4周，G418浓度减为半量 (0.45 g/L)，继续维持筛选压力。荧光显微镜下可见散在绿色荧光细胞，拍照。以后每2～3天换用培养基及G418。胰酶消化依次至12孔、6孔板、10 cm板行扩大培养，留待后续鉴定实验用，建立稳定转染pLNCX2-ARHI-EGFP和pLNCX2-EGFP的多克隆细胞株。 Western Blot检测 制备SDS-PAGE凝胶，按顺序将蛋白样品加至上样孔中，转膜和封闭、抗体孵育及曝光。ARHI抗体购自 Abcam公司 (英国)，抗体稀释比例为1∶100;β-actin抗体购自Sigma公司 (美国)，稀释比例为1∶10 000。 统计学处理 根据图像灰度计算蛋白条带相对表达量，采用统计学 ANOVA方法计算 pLNCX2-ARHI-EGFP组、pLNCX2-EGFP和PANC-1细胞空白对照组之间蛋白表达差别。蛋白检测结果数据表达采用均数±标准差，每组实验重复4次。应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果ARHI基因转染后细胞表达ARHI基因mRNA和蛋白 稳定转染胰腺癌细胞株ARHI基因后，经过G418筛选出PANC-1多克隆稳定细胞株，通过RT-PCR方法鉴定PANC-1细胞株中ARHI的表达情况，结果显示稳定转染组 (pLNCX2-ARHI-EGFP)检测到ARHI基因mRNA和蛋白质 (图1)。 ARHI基因转染后HuR蛋白表达情况 转染pLNCX2-EGFP、pLNCX2-ARHI-EGFP后，经过G418筛选出PANC-1多克隆稳定细胞株 (图2，3)，采用鉴定ARHI基因转染成功的同期细胞，检测HuR蛋白的表达，根据图像灰度计算蛋白条带相对表达量，稳定转染ARHI基因组HuR蛋白表达 (0.2226±0.0644)较空载体对照转染组 (0.4063±0.0925，P=0.029)和PANC-1细胞空白对照组 (0.4178±0.1319，P= 0.022)显著降低 (图4)。  图1 鉴定细胞株中ARHI基因和蛋白的表达 A.RT-PCR鉴定ARHI mRNA在多克隆稳定株中的表达;  图2 空载体转染组稳定转染细胞株普通光镜和荧光显微镜下的观察 A.普通光镜，×10;B.荧光显微镜，×10  图3 实验组组稳定转染细胞株普通光镜和荧光显微镜下的观察 A.普通光镜，×10;B.荧光显微镜，×10  图4 ARHI基因转染胰腺癌细胞后HuR蛋白表达情况 A.Western blot检测HuR蛋白表达情况;B.利用图像灰度计算HuR蛋白条带相对表达量，*P＜0.05 讨论mRNA水平的转录后调控是基因表达中的重要调控点。转录后基因的调控通过改变翻译效率和mRNA稳定性实现，其中RNA结合蛋白对于这种调控有重要作用［3］，HuR是一种重要的mRNA结合蛋白［4］，主要定位在细胞核，与靶基因的mRNA结合形成复合物，保护mRNA避免衰变降解，起到稳定作用［5］。研究显示，HuR对肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、侵袭转移、血管新生和免疫逃避发挥广泛作用［6］。 HuR表达在胰腺癌中的作用已得到证实，HuR调控脱氧胞苷激酶mRNA表达，从而调节药物敏感性［7］。降低HuR表达可显著抑制胰腺癌细胞株和移植瘤的生长。HuR在胰腺癌中的调控通路包括细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖相关的多条通路［8］。 然而尚不清楚HuR在胰腺癌中受到哪些因素的调节，本研究结合前期工作，探讨ARHI基因与HuR蛋白之间的相互关系。ARHI基因是胰腺癌的抑癌基因，ARHI蛋白在正常胰腺组织中广泛表达，在胰腺癌组织中表达下调。ARHI基因再表达可抑制胰腺癌PANC-1细胞系增殖，诱导凋亡和自噬等。由于ARHI基因是母源性印记基因，可能是胰腺癌发生的早期事件，故该基因静息后可能会通过一些重要的调控RNA或者蛋白对下游的基因和信号通路起作用。 本研究中将ARHI基因转染至胰腺癌细胞株，诱导AHRI基因再表达，而ARHI基因再表达后出现HuR蛋白的显著减低 (P=0.029)。这个结果提示ARHI基因促进胰腺癌细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能可能与降低HuR蛋白表达有关。而HuR蛋白与ARHI基因之间如何相互作用还需进一步验证。 总之，RNA结合蛋白占细胞编码蛋白的6%～8%，已经证实其中几种RNA结合蛋白 (如HuR，AUF1，TTP，TIA1，CUGBP2等)可特异参与mRNA稳定性、翻译或其他层面的基因调控。HuR作为公认的mRNA结合蛋白，许多文献报道其参与胃癌、宫颈癌的发生发展过程，阻遏HuR胞质转移或者直接抑制HuR活性可以抑制肿瘤的发生［9-10］。本研究观察了ARHI基因与HuR蛋白的关系，进一步揭示了ARHI基因抑制胰腺癌发生的可能机制和通路，为指导胰腺癌分子靶向治疗提供新的思路。 参 考 文 献： ［1］ Yu Y，Xu F，Peng H，et al．NOEY2(ARHI)，an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas［J］．PNAS，1999，96:214-219． ［2］ Yang H，Lu X，Qian J，et al．Imprinted tumor suppressor gene ARHI induces apoptosis correlated with changes in DNA methylation in pancreatic cancer cells［J］．Mol Med Rep，2010，3:581． ［3］ Yang H，Rao JN，Wang JY．Posttranscriptional regulation of intestinal epithelial tight junction barrier by RNA-binding proteins and microRNAs［J］．Tissue Barriers，2014，2:e28320． ［4］ Liu L，Christodoulou-Vafeiadou E，Rao JN，et al．RNA-binding protein HuR promotes growth of small intestinal mucosa by activating the Wnt signaling pathway［J］．Mol Biol Cell，2014，25:3308-3318． ［5］ Blancoo FF，Jimbo M，Wulfkuhle J，et al．The mRNA-binding protein HuR promotes hypoxia-induced chemoresistance through posttranscriptional regulation of the proto-oncogene PIM1 in pancreatic cancer cells［J］．Oncogene，2016，35: 2529-2541． ［6］ Jimbo M，Blanco FF，Huang YH，et al．Targeting the mRNA-binding protein HuR impairs malignant characteristics of pancreatic ductal adenocarcinoma cells［J］．Oncotarget，2015，6:27312-27331． ［7］ Costanitino CL，Witkiewica AK，Kuwano Y，et al．HuR's role in gemcitabine efficacy in pancreatic cancer:HuRupregulates the expression of the gemcitabine metabolizing enzyme，deoxycytidinekinase［J］．Cancer Res，2009，69: 4567-4572． ［8］ Romeo C，Weber MC，Zarei M，et al．HuR contributes to TRAIL resistance by restricting death receptor expression in pancreatic cancer cells［J］．Mol Cancer Res，2016，14: 599-611． ［9］ 王敏，彭宣荣，朱彦丽，等．HuR VEGF和COX-2表达及临床病理因素与早期宫颈癌患者预后关系的分析［J］．中国肿瘤临床，2010，37:984-990． ［10］ 胡跃云，吴宏菊，辛彦，等．HuR蛋白在胃癌组织中的表达及其意义［J］．中华临床医师杂志，2011，5:91-95． Expression of ARHI and HuR in PANC-1 Cells YANG Hong，HU Shan-shan，RUAN Ge-chong，YANG Xiao-ou，QIAN Jia-ming Department of Gastroenterology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China Corresponding author:QIAN Jia-ming Tel:010-65295019，E-mail:qianjiaming1957@126．com 【Abstract】Objective To investigate the effect of ARHI transfection on the expression of HuR protein in PANC-1 cells．Methods Plasmids pLNCX2-ARHI-EGFP which express ARHI and empty plasmid pLNCX2-EGFP were used to transfect PANC-1 cells，which were divided into three groups:pLNCX2-ARHI-EGFP group，pLNCX2-EGFP group，and blank control．G418 was used to select stable transfected cell lines．ARHI gene expression was detected by PCR and Western blot，and the expression of HuR protein was detected by Western blot．Results PANC-1 cells transfected with pLNCX2-ARHI-EGFP，the mRNA and protein expression of ARHI were detected．HuR protein expression appeared significantly decreased in PANC-1 cells transfected with pLNCX2-ARHI-EGFP(0.2226±0.0644)compared with the pLNCX2-EGFP-transfected cells(0.4063± 0.0925，P=0.029)and PANC-1 blank control cells(0.4178±0.1319，P=0.022)．Conclusion ARHI gene in PANC-1 cells may reduce the expression of HuR protein． 【Key words】pancreatic cancer;ARHI;HuRMed J PUMCH，2017，8(1):39－42 【中图分类号】［R34］ 【文献标志码】A 【文章编号】1674-9081(2017)01-0039-04 DOI：10.3969/j.issn.1674-9081.2017.01.009 (收稿日期：2016-05-09) 基金项目：国家自然科学基金 (81072055);国家教育部博士点专项基金－新教师基金 (20101106120059) |
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