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基因工程复习试题 (名词解释和问答 仅供参考) 名词解释: 1、基因工程(genetic engineering): 就是在分子水平上，提取(或合成)不同生物的遗传物质(基因)，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA 分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA(基因)在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下代。 2、载体(vector):基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 3、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):定义:是一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 主要从原核生物中分离纯化出来。 4、1)同裂酶(isoschizomers): 来源不同，识别位点和切割位点均相同的限制性内切酶。即同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同裂酶对识别序列的甲基化状态有不同的限制性反应。2)同尾酶(isocaudamer):来源不同，识别序列也不相同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。3)同位酶:识别序列相同，但切割位点不同。 5、酶活性单位:1个酶活性单位就是指1min能转化1mmol底物的酶量。 6、DNA连接酶:能催化双链DNA片段靠在一起的3′羟基末端和5′端磷酸基团末端之间形成的磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。 7、DNA聚合酶:作用是指在引物和模板的存在下，把脱氧核糖核苷酸(dNTP)连续地加到引物链的 3’ –OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 8、DNA连接酶能够封闭双螺旋DNA骨架上的缺口，但不能封闭裂口。缺口(nick):即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂; 9、常用连接酶:E.coli DNA 连接酶 、T4 DNA 连接酶(常用)。既能进行粘性末端的连接，又能进行平末端的连接，但E.coli DNA 连接酶进行平末端连接的效率低。 10、DNA连接酶的连接条件:必须是两条双链DNA、一条链的3‘末端有游离的羟基(-OH)，而另一条链的5’端具有一个磷酸基团(-P)、需要能量(ATP或NAD+)。 11、T4多核苷酸激酶:是一种磷酸化酶，可将ATP的磷酸基团转移到DNA或RNA的5‘末端。1)5‘加磷酸基团。对于缺乏5‘磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化。2)末端标记。 12、末端转移酶TDT 来源:小牛胸腺 活性:不依赖模板的 DNA 聚合酶，能催化 dNTP 掺入 DNA 3′-OH 末端。当反应液中只有一种脱氧核苷酸时，可形成仅有一种核苷酸组成的3′尾巴，称之为同聚物加尾。功能:1)主要用于给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，便于连接。2)末端标记 13、碱性磷酸酶:细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase，简称BAP)、小牛肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，简称CIP)特性:催化除去DNA或RNA 5′端的磷酸基团。功能:1)DNA分子片段5′末端的去磷酸化，防止自身连接。2)可作为5′-末端标记的DNA片段。 14、分子杂交技术:分子杂交是用于检测混合样品中特定的核酸分子和蛋白质分子是否存在，以及其相对分子质量的大小的一种方法。杂交技术:是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的技术。 15、Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 分子杂交:预杂交: 将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起 1/7页 来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。杂交:在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。洗膜: 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。 16、探针(probe):用作检测的被标记的短片段特异DNA或RNA序列。 17、探针的种类:基因组DNA探针、 cDNA 探针、寡核苷酸探针、RNA探针 18、标记物:同位素标记:32P、35S、3H等。非同位素标记:地高辛、生物素、荧光素等 19、Northern 杂交:检测特定RNA(主要是mRNA)分子的方法。与Southern杂交的不同:靶核酸:RNA RNA电泳: 变性凝胶电泳 应用:主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况 20、Western 杂交:蛋白杂交/蛋白质的免疫印迹。检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是 DNA 或 RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因表达与否、表达量、分子量。 21、聚合酶链式反应PCR:是一种选择性体外扩增DNA方法，能在短时间内大量扩增特定的,,,片段的分子生物学技术。 22、核酸分子杂交:Southern blotting用DNA(或RNA)探针检测DNA样品从宿主细胞中提取质粒载体DNA，再用探针杂交。只有带有插入片段的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。 23、基因文库(gene library):在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA(或来自某一组织所有不同的mRNA的每一种cDNA分子)所形成的全部DNA片段克隆的集合体。 24、基因组文库:指将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所得的重组子群体的总称。 25、cDNA文库 (cDNA library) :是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 26、克隆载体(cloning vector) 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。 27、表达载体(Expression vector):除具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)，还应具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的RBS (核糖体结合位点) 、终止子等。 这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。
28、基因:是遗传的物质基础，是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷 酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。 29、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然 后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成 某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。 30、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。 在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的 启动子、增强子样结构统称启动子。 31、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约 200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原 2/7页 核生物中都发现了增强子。增强子通常占100,200bp长度，也和启动子一样由若干组 件构成，基本核心组件常为8,12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。 32、RACE:是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成 ，，cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5端之间未知序列的方法。 33、Probe:探针:指被标记物质标记了的核酸。 34、RT-PCR:逆转录PCR:先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR。 35、S-D Sequence:S-D序列:在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始 ，密码子及同16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine 、Dalgarno发现，故后来命名为Shine—Dalgarno 序列，简称S-D序列。 36、MCS:指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 37.重叠基因 :不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因 38(.锌指结构:由两个半胱氨酸(Cys)残基和两个组氨酸(His)残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构, 并以锌辅基敖合形成的环状结构作为活性单位, 在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关 39(.基因置换:是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。 40(基因敲除:基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术。具有生物活性的蛋白质分子。 41、DNA变性:DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。 42、DNA复性:变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。 43、退火:指模板双链DNA经热变性，螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到55?左右，使引物(即具有互补碱基的RNA片段)与该模板DNA单链重新配对，形成新的双链分子的过程。 44、DNA芯片:是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。 45、错义突变:碱基替换的结果引起氨基酸顺序的变化。 46、基因诊断:又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。 47、核酸探针:是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。 48、转录:转录是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA以及非编码RNA(tRNA、rRNA等)的合成步骤。 49.分子克隆技术:指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术 50.基因工程的含义:按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物(供体)的遗传物质(DNA )直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物(受体)中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 3/7页 51.黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来 52.转导:通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程 53.重组子:含有重组DNA分子的转化子 54.DNA接头 它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 55.SD序列:mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始 56.转化:受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。 57.转化子(transformant):通过转化方式而形成的杂种后代。 58.感受态:指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。 59.转染:将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程 60.重组子的筛选:经过各种方法将外源DNA分子导入受体，获得所需目的重组子的过程。 61.筛选:进一步检测目的重组子:通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。 62.终止子:在一个基因的3’端或是一个操纵子的3 ’ 端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子 63.融合蛋白:是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。 64.DNA重组:是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。 65.克隆:科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 66.DNA克隆:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。 67.目的基因:把需要研究的基因称为目的基因。(一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。) 68.基因载体:基因载体是把基因导入细胞的工具，他的作用是?运载目的基因进入宿主细胞，?使之能得到复制和进行表达。 二、问答 1、什么是蓝白斑筛选法, 答:这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在,载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌,—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的,载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—,—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转 -入lac宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—,—D—半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。 4/7页 2、什么是基因文库, 用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆)，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。 3、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。 答:黏性末端连接法不足之处有:(1)载体易自身环化;(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆;(3)难插入特定的基因;(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向;(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。 4、常用的工具酶有哪些,其主要用途是什么, 答:限制性内切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA连接酶,碱性磷酸酶,末端脱氧核苷酸转移酶. 限制性内切核酸酶, 能够识别特异的DNA碱基序列， DNA碱基序列往往呈回文对称结构; DNA 聚合酶 a 位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用; Klenow大片段它也可以通过基因工程得到，分子量为 76kDa 。 DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。 碱性磷酸酯酶的作用是从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基。 末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到DNA分子的3`-OH末端。 5、重组DNA技术常包括哪些基本步骤, 答:?获得目的基因; ?与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子; ?用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传; ?对转化子筛选和鉴定。在具体工作中选择哪条技术路线; ?对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。 6、常用的目的基因的获取方法有哪些, 直接获取从基因文库中提取目的基因，使用PCR扩增技术获得目的基因; 人工合成. 答: 7、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些, 答:外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用(一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素: (1)实验步骤要尽可能地简单易行; (2)连接形成的'接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段; (3)对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 8、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。 答:质粒是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质。 质粒:(1)具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段; (2)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 9、何谓限制性核酸内切酶,写出大多数限制性核酸内切酶识 DNA 序列的结构特点。 答:限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA 5/7页 |
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