MACC1在结肠癌中的表达及与上皮间质转化的关系刘浩峰*，陈铁，江晓晖，孙跃明 （南通市肿瘤医院普外科，江苏 226361） ［摘要］目的：研究MACC1在结肠癌组织中的表达及其在结肠癌EMT过程中的作用。方法：按结肠癌病理分期，将患者标本分位N组（距肿瘤5cm的正常组织）、AB组（I，II期），CD组（III，IV期），采用RT-PCR检测MACC1在各组中的表达情况；将融合绿色荧光蛋白（green fluorescent proteins，GFP）的质粒干扰具有转移能力的结肠癌细胞株HCT116，应用RT-PCR、Western blot检测下调MACC1后EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin）表达情况，应用划痕实验和Transwell实验比较转染前后细胞的侵袭迁移能力。结果：RT-PCR结果显示MACC1在结肠癌组织中表达较正常黏膜组织明显增高（P＜0.05）；有淋巴结转移的较未发生淋巴结转移的表达增高（P＜0.05）；HCT116经干扰后，E-cadherin蛋白表达升高、Vimentin蛋白表达降低，侵袭转移能力降低（P＜0.05）。结论：MACC1基因在结肠腺癌组织中过表达，与结肠癌的侵袭、转移密切相关。MACC1基因促进了结肠腺癌的EMT过程，增强了肿瘤细胞的侵袭转移能力。 ［关键词］MACC1；结肠癌；上皮-间质转化；HCT116 结肠癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，已超越心脑血管疾病，严重威胁人类的身心健康。虽然近年来肿瘤的早诊早治和综合治疗有了长足的进步，但是复发与转移仍是影响预后的主要原因。因此进一步研究结肠癌复发、转移的分子机制，具有重要的临床意义。结肠癌转移相关基因-1（metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）是由Stein等［1］在2009年报道的一种调控肿瘤生长和转移的重要基因，越来越多的研究表明，MACC1在存在腹膜种植转移的胃癌［2］、肺癌［3］和食管癌［4］等癌组织中高表达。MACC1在肿瘤生物学行为中的作用也越来越受到关注。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）最早由Greenberg等［5］在1982年提出，是指上皮细胞失去上皮表型，从而获得间充质表型的转化过程。众多研究指出，EMT过程与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关［6-8］。本实验收集2011—2014年我院普外科住院患者结肠癌新鲜标本及癌旁正常肠上皮组织（距癌组织距离＞5cm）标本，通过RT-PCR方法检测结肠癌组织及正常癌旁黏膜组织MACC1的表达情况，探讨MACC1在结肠癌演变过程中的作用及生物学意义，为结肠癌的预后评估及未来寻找新的治疗靶点提供依据。 1 材料和方法1.1 标本来源本组结肠癌患者术前均未行新辅助放化疗，研究标本的收集均获得患者知情同意。实验各组标准：N组：距肿瘤组织5cm正常结肠组织；AB组：病理分期I、II期结肠腺癌组织；CD组：病理分期III、IV期结肠腺癌组织；每组样本量为25例。 1.2 主要试剂和引物HCT116结肠癌细胞系为病理证实有淋巴结转移的结肠癌细胞，购自ATCC细胞库。兔抗人MACC1多克隆抗体（稀释浓度1∶1 000，ABCAM公司），兔抗人E-Cadherin，Vimentin多克隆抗体（稀释浓度均为1∶1 000，Cell Signaling公司），鼠抗人β-actin单克隆抗体（稀释浓度1∶10 000，上海康成生物工程有限公司），SYB Green试剂盒、X-tremeGENE HP DNA转染试剂盒（罗氏公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），PCR引物利用软件Primer Premier 5.0设计特异引物（上海英潍捷基生物工程有限公司合成）。 1.3 实验方法 1.3.1 RT-PCR：Trizol提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，按SYB Green试剂盒说明书将特异性引物、目的基因（内参基因）cDNA、SYB Green、DEPC水配置成PCR反应液，使用BIO-RAD公司RT-PCR分析仪进行PCR反应。然后进行相对定量分析。ΔCT= CT（目的基因）-CT（内参基因），ΔΔCT=研究样本的ΔCt减去对照组样本的ΔCt，2^（-ΔΔCT）表示目的基因mRNA的相对表达量。PCR引物见表1。 表1 PCR引物  1.3.2 转染：购置干扰质粒（上海吉玛制药技术公司），MACC1 shRNA为MACC1干扰组，shNC为对照组，参照X-tremeGENE HP试剂盒说明书,将HCT116细胞与MACC1 shRNA、shNC共培养，6h后换液，继续恒温培养箱内培养，48h提取总RNA，72h提取总蛋白。 1.3.3 Western blot：蛋白裂解液分别提取转染前后HCT116总蛋白。各取40μL进行10%SDS-PAGE电泳，250mA恒流湿转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2h，分别用MACC1、E-cadherin， Vimentin（稀释浓度均为1∶1 000）、β-actin抗体（稀释浓度均为1∶10 000）4℃过夜，二抗室温孵育2h，洗膜后加入显影液，曝光，扫描图像后用Image-Pro Plus软件用灰度值比较蛋白相对表达量。 1.3.4 划痕实验：将实验组与对照组细胞计数后按每孔5×105均匀铺在六孔板上，使用胎牛血清（Wisent公司）培养，用200μL枪头划痕，分别在0h、24h、48h在显微镜下观察迁移距离，计算迁移率，迁徙率=（对照组迁徙细胞数-实验组迁徙细胞数）/对照组迁徙细胞数。 1.3.5 Transwell体外侵袭实验：先将实验组及对照组细胞饥饿培养24h，消化后，用含BSA的无血清培养基重悬，取100～200μL悬液加入Transwell小室，下室加入500μL含FBS的培养基，培养12～48h，用结晶紫染色，显微镜下计数。 1.4 统计学处理采用SPSS 19.0统计学软件进行处理，计量数据以均数±标准差（ 2 结果2.1 MACC1在结肠癌组织中的表达RT-PCR结果显示，MACC1 mRNA在结肠癌组织中表达较正常黏膜组织明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），发生淋巴结转移癌组织MACC1 mRNA的表达较未发生淋巴结转移癌组织明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。 2.2 干扰HCT116细胞MACC1表达对E-cadherin及Vimentin表达的影响干扰后，在mRNA水平以及蛋白水平均显示MACC1表达降低，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图2。  图1 MACC1 mRNA在结肠癌组织及正常组织中的表达 2.3 下调MACC1基因对HCT116细胞迁移能力的影响划痕实验结果显示，24h、48h后，干扰组MACC1-shRNA细胞的迁移率低于对照组shNC（P＜0.05），差异有统计学意义，提示下调MACC1基因能够降低HCT116细胞体外迁移能力。见图3。  图2 转染后，MACC1、E-cadherin、Vimentin mRNA（左）、蛋白（右）水平的表达情况 2.4 下调MACC1基因对HCT116细胞侵袭能力的影响Transwell实验结果显示，干扰组侵袭细胞数显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示下调MACC1基因能够降低HCT116细胞的体外侵袭能力。见图4。  图3 划痕实验0h，24h，48h迁移率  图4 Transwell实验侵袭细胞计数 3 讨论结直肠癌是我国最常见的消化道肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，发病率年均上升3%～4%［9］。I期结直肠癌的5年生存率为90%，但出现局部淋巴结转移时则下降至65%，IV期患者则不高于10%［10］，肿瘤复发、转移的分子机制已成为现今研究的热点。 恶性肿瘤的预后判断一直是临床面临的重大难题之一，原因是没有一个敏感的指标来指示患者是否会复发或者转移。MACC1是一个很好的推断癌症预后的指标，并且该指标是一个不受年龄、性别、肿瘤浸润、肿瘤形状影响，不依赖于其他因子的独立指标［1］。本研究发现，MACC1表达量的高低与肿瘤患者的预后直接相关，即表达量越高，预后越差，生存率越低，MACC1有可能成为提示结肠癌预后及复发转移危险性的重要指标之一。 MACC1基因跟结肠癌的复发转移密切相关。E-cadherin表达缺失被认为是EMT的重要标志。我们通过干扰MACC1在结肠癌细胞中的表达后，结果提示E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调。结肠癌细胞侵袭、转移实验结果提示，MACC1基因表达的降低，直接抑制结肠癌细胞的侵袭、转移能力。由此可见MACC1能促进结肠癌的EMT过程。 HGF/Met信号通路是MACC1影响肿瘤转移的重要通路之一［1］，异常的HGF/Met信号触发肿瘤发生过程的各种恶性行为，其中就有EMT过程［11-14］。本实验结果显示干扰MACC1的表达能明显抑制EMT过程，减弱肿瘤细胞的迁徙转移能力。我们认为MACC1调节HGF/Met信号通路，通过反馈作用影响肿瘤的EMT过程，可能为寻找结直肠癌新的治疗靶点提供方向，今后需要更多的动物实验及临床试验来深入研究MACC1在结直肠癌的发生发展过程中的作用。 ［参考文献］ ［1］Stein U，Walther W，Arlt F，et al.MACC1，a newly identified key regulator of HGF-MET signaling，predicts colon cancer metastasis［J］.Nat Med，2009，15（1）：59-67. ［2］Shirahata A，Sakata M，Kitamura Y，et al.MACC 1 as a marker for peritoneal-disseminated gastric carcinoma［J］. 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The expression of MACC1 in colon adenocarcinoma and the relationship between MACC1 and epithelial mesenchymal transition LIU Haofeng,CHEN Tie,JIANG Xiaohui,SUN Yueming ［Abstract］Objective:To investigate the expression of MACC1 in colon adenocarcinoma and the relationship between MACC1 and epithelial mesenchymal transition of colon adenocarcinoma.Methods：According to the pathological stage in 2013 NCCN Guidelines,we divided tissue samples into three groups,group N(the normal tissue 5cm away from tumor)、group AB(stage I and II)、group CD(stage III and IV).RT-PCR was used to determine the expression of MACC1 mRNA in three groups.We used plasmid with green fluorescent proteins to down-regulated the MACC1 gene expression of HCT116 which had liver metastasis abilities,RT-PCR and Western blot to examine the expression of MACC1，E-cadherin and Vimentin.We used wound healing assay to observe the cell motility rate and Transwell method to observe cell invasiveness in vitro.Result:The RT-PCR examination showed that the expression of MACC1 in colon adenocarcinoma tissues were significantly higher than that in normal rectum tissues,(P＜0.05).What’s more,the expression of MACC1 in the adenocarcinoma tissues which had lymph node metastasis were higher than that had no lymph node metastasis,(P＜0.05).After we down-regulated the MACC1 gene expression of HCT116,we used RT-PCR and western blot methods to examine the transfection result.We found that the expression of E-cadherin was up-regulated and the expression of Vimentin was down-regulated,the metastasis and invasion abilities were down-regulated(P＜0.05).Conclusion:MACC1 was up-regulated expression in colon adenocarcinoma，and was closely related to tumor metastasis.MACC1 promotes the EMT of colon adenocarcinoma and it enhances the metastasis ability of colon cancer. ［Key words］MACC1;colon adenocarcinoma;Epithelial-mesenchymal transition;HCT116 ［中图分类号］R735.3+5 ［文献标志码］A ［文章编号］1006-2440（2016）05-0434-05 ［收稿日期］2016-09-08 *［作者简介］刘浩峰，男，汉族，江苏南通人，生于1987年9月，硕士，住院医师。研究方向：胃肠肿瘤诊治。通信作者：孙跃明，E-mail: jssym@vip.sina.com |
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±s）表示，组间差异性比较采用配对t检验，计数资料差异性比较采用卡方检验及Fisher精确概率计算法，P＜0.05为差异具有统计学意义。
