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同时检测E-cadherin和N-cadherin 蛋白的表达，总是只有其中一个蛋白表达，而另一个不表达，这是抗体的问题吗？ 这可能是不少人的困惑，回答这个问题，就不得不说说“E-cadherin、N-cadherin，谁是肿瘤侵袭主角”的问题了。本文作者将从“E-cadherin和N-cadherin在正常细胞、组织及肿瘤样本中的表达情况”以及“分别分析E-cadherin、N-cadherin 在 EMT 及肿瘤侵袭、转移中的作用”两个角度给出答案。最后，对于WB实验中两个蛋白的检测，也指出了操作的关键点。 说起 E-cadherin、N-cadherin 这两个蛋白，我们第一时间是不是关联到EMT（Epithelial-mesenchymal transition，上皮间充质转化）？毫无疑问，这两个蛋白是研究EMT过程最常见的钙粘蛋白。为了对这两个蛋白有个基本的了解，我们先来看看什么是EMT? EMT 简要科普 EMT是正常胚胎发育的一个重要过程，也是最常见的肿瘤侵袭和转移的起始原因（1-3）。EMT的一个标志特征是上皮细胞完整性的丢失，而这种丢失会伴随维持上皮细胞间接触的黏附连接下降。这种下降的驱动因素之一是基质金属蛋白酶 (MMP) 进行蛋白水解消化。促 EMT 转录因子（例如 SNAIL）对编码上皮细胞特异性蛋白（例如 E-Cadherin, Occludins, Desmoplakins）的基因转录抑制作用会进一步促进粘附连接的降解。在 EMT 过程中，上皮细胞粘附连接的蛋白被能提供更大连接灵活性的蛋白（例如N-Cadherin）取代，从而导致细胞分离和细胞运动性增强（4）。如图1所示，这种严格调控的过程与许多细胞和分子事件有关。  图1.细胞外基质对 EMT 的作用信号通路图（点击查看动态通路图） 拓展：关于可溶性因子对EMT的作用，请点击此处查看。 钙粘蛋白介导钙依赖性细胞粘附并在正常组织发育中发挥关键作用。那么在正常的组织中，E-cadherin和N-cadherin的表达分别是什么样的呢？通过Biogps 的检索，我们得知在绝大部分的组织和细胞中，E-cadherin的表达是可以检测到的，而N-cadherin 只在心肌、平滑肌及睾丸的细胞中表达较高，其他组织表达非常弱，基本检测不到（图2、3所示）。所以，在正常的组织和细胞中，E-cadherin和N-cadherin很少同时都高表达。也就是说，大多数正常的细胞和组织中，当能检测到E-cadherin的信号，N-cadherin不一定有明显的信号。  图2. E-cadherin 的表达谱（来自Biogps 网站）  图3. N-cadherin 的表达谱（来自Biogps 网站） 了解了正常组织中这两个蛋白的表达后，再来看看它们在肿瘤细胞中的表达情况。研究表明，癌细胞除了失去E-Cadherin外，还具有上调的N-Cadherin的现象。这种钙粘蛋白表达的变化被称为“钙粘蛋白开关”。也就是说，大部分肿瘤细胞中的E-Cadherin的表达是下调的，而N-Cadherin的表达会增加。但不能一概而论，来看一组来自CST 内部的数据，图4和图5 分别是用E-Cadherin (4A2) Mouse mAb #14472和E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb #3195 检测不同的细胞系中E-Cadherin的表达，其中，MCF7 乳腺癌细胞有明显的E-Cadherin表达，其他的上皮细胞及其来源的肿瘤细胞——如PHPAC （人胰腺癌细胞）、mIMCD-3(小鼠肾上皮细胞)、 HCT116 (人结肠癌细胞) 、T-47D（人上皮细胞）中也可以看到E-Cadherin的高表达；值得注意的是，C2C12 （小鼠成肌细胞）中没有E-Cadherin的表达。  图4.来自E-Cadherin (4A2) Mouse mAb #14472 产品说明书  图5.来自E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb #3195 产品说明书 而N-Cadherin 在MCF-7 细胞中不表达（如图6、7所示）。A172(人胶质瘤细胞)和PANC-1(人胰腺癌细胞)中N-Cadherin的表达是很高的。  图6.来自N-Cadherin (D4R1H) XP® Rabbit mAb #13116 产品说明书  因此，当我们不清楚自己研究的样本中E-cadherin和N-cadherin的表达情况时，可以用野生型的MCF-7细胞系作为参照。 看来并不是所有的肿瘤细胞都表达N-cadherin而不表达E-cadherin, “钙粘蛋白开关”的理论在大多数情况下是适用的。但不是所有的肿瘤细胞都如此，肿瘤的发病非常复杂，从而导致同一肿瘤分类多样化，同一肿瘤不同的类型E-cadherin和N-cadherin的表达差异就很大（图8）。早期的研究认为E-Cadherin是肿瘤抑制因子。早期文献报道，来源于E-cadherin阴性上皮细胞肿瘤往往是侵袭性的，而来源于E-cadherin阳性肿瘤往往不是（5）。后来又有文献报道E-cadherin的表达下降与乳腺癌细胞的侵袭没有必然相关性；N-Cadherin的表达才对乳腺癌细胞的运动和侵袭起到直接作用（6）。因此，对于乳腺癌, N-Cadherin才是肿瘤侵袭的关键蛋白。  图8.不同乳腺癌细胞中E-cadherin和N-cadherin的表达，来自文献（6） 大多数肿瘤中，N-Cadherin都可以作为肿瘤侵袭的启动子，经常被上调。上皮细胞中N-Cadherin的表达可诱导成纤维细胞表型的形态学改变，使细胞更具运动性和侵袭性。然而，有一些癌症，如骨肉瘤，N-Cadherin可能表现为肿瘤抑制。N-Cadherin根据细胞环境促进粘附或诱导迁移而具有多种功能。在各肿瘤细胞中的表达如下：  图9. N-Cadherin在人癌细胞系和活检中的表达，来自文献(7) 所以，对于正常的上皮细胞和来源组织，E-Cadherin的表达是广泛的；而上皮来源肿瘤组织细胞中，N-Cadherin的表达往往会上调，可见N-Cadherin对肿瘤的侵袭和转移的作用不可忽视。但是，具体的特定类型的肿瘤细胞和组织还需查找文献进行分析，也可参考本文的各种图片和表达。 最后，需要强调一点，做E-Cadherin和N-Cadherin的WB 实验时，不要忘记在蛋白提取时对裂解后的样本进行超声，因为钙粘蛋白是跨膜糖蛋白的一个超家族，其胞外结构域中含有约100个残基的钙粘蛋白重复序列。为了让这两个蛋白的表位充分暴露出来，请对样本进行超声，超声，再超声！如果你使用的是探头直径为3mm的接触式超声仪，CST 建议的超声条件是10-15s，3次(期间每次间隔10s)。如果没有超声仪，请用1ml带针头注的射器冰上反复抽吸10-15次，直到裂解液澄清好吸为止；然后进行离心，取上清蛋白。更多优化的WB 实验步骤，请参考以前的文章。 相关产品：
参考文献： 1. Wheelock, M.J. and Johnson, K.R (2003) Annu Rev Cell Dev Biol 19, 207-35. 2. Christofori, G. (2003) EMBO J 22, 2318-23. Hazan, R.B. et al. (2004) Ann N Y Acad Sci 1014, 155-63. 3. Lamouille S, Xu J and Derynck R.(2014)Nat Rev Mol Cell Biol.15(3):178-96. 4. Pierceall, W.E., et al.(1995) Oncogene. 11:1319–1326. 5. Marvin T. et al.(1999) The Journal of Cell Biology.147(3),631–643. 6. Lara D.M. Derycke and Marc E. Bracke (2004) Int. J. Dev. Biol. 48: 463-476 (2004). |
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