【原】三阴性乳腺癌标志物的临床意义

黄小彦，池瑞霞，刘铭　

李景曦，曾婉姗，谢文杰

澳门仁伯爵综合医院　　　

新疆医科大学第一附属医院

香港中文大学威尔斯医院　

　　乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，这种异质性体现在不同肿瘤类型之间以及同一肿瘤内部之间等多层次的差异，亦表现在传统的组织病理分型/免疫组织化学（IHC）特征的分型和近期依据基因表达谱（GEP）的分子分型上【1】。根据最新版WHO分类，基于不同的生长方式、组织学结构和细胞学形态，乳腺癌可分为21种不同的组织学类型【2】。不同类型的肿瘤具有不同的组织学形态、基因表达及预后特征。使用分子分型可将乳腺癌分为不同的亚型，包括表达雌激素受体（ER）相关因子的亚型（管腔型）、表达人类表皮生长因子受体2（HER2）相关通路因子的亚型（HER2过表达亚型）和表达基底因子但不表达激素受体通路的基底样乳腺癌（BLBC）亚型。在日常应用中，依据GEP分析的分子分型常常被IHC分型所替代。通过IHC分型方法【3】，乳腺癌被划分为激素受体（ER、PR）阳性组和阴性组，后者根据HER2表达情况进一步分为HER2过表达乳腺癌和三阴性（ER、PR、HER2阴性）乳腺癌（TNBC）。2013年，圣加伦国际乳腺癌会议专家组再次确认IHC分类法，以乳腺癌IHC分型替代GEP分子分型：管腔A型（ER阳性，PR≥20%，HER2阴性，Ki-67＜20%）；管腔B型（ER阳性，PR＜20%和/或HER2阳性和/或Ki-67≥20%）；HER2过表达型（ER阴性，PR阴性，HER2阳性）；基底样型（ER阴性，PR阴性，HER2阴性）【4】。尽管这种IHC分类方法便于使用，但与GEP分型并不完全一致【4,5】。

　　在对乳腺癌的常规评估中，ER、PR、HER2和Ki-67的免疫组织化学检测以及肿瘤的组织学类型、组织学分级、肿瘤分期、脉管浸润和淋巴结情况都是作为判断预后和指导临床治疗的重要参数【6】。在多种分子分型中，BLBC因其预后差、对内分泌治疗和靶向治疗不敏感、缺乏有效的治疗方法而成为临床研究的重点。通过GEP分析划分的BLBC占所有乳腺癌的15%【7】。大约85%的BLBC为ER、PR和HER2阴性（三阴性）【8】。尽管GEP分析是BLBC诊断的金标准，但在常规工作中难以应用，而是普遍使用ER、PR和HER2三阴性表达的IHC方法替代【9】。TNBC占所有乳腺癌的10%～20%，好发于年轻患者【10】，多为高级别肿瘤【11】，具有较高的复发风险，通常在诊断3～5年内死亡【12】。TNBC是一组异质性肿瘤，包含不同的组织学类型，多数为高级别非特殊类型浸润性导管癌，其他类型包括化生性癌、具有髓样特征的癌、“大汗腺”癌，还包括腺样囊性癌和分泌性癌等预后良好的类型，每种类型均有不同的形态和生物学行为。多数TNBC可表达基底样标志物。

　　虽然三阴性可用作替代定义BLBC，但TNBC和BLBC并不完全吻合。PAM50基因固有亚型分析显示，TNBC中1.6%为管腔A型，3.2%为管腔B型，9.1%为HER2过表达，只有86.1%为BLBC【13】。即使釆用5种IHC标志物（ER阴性、PR阴性、HER2阴性、CK5/6阳性和/或表皮生长因子受体[EGFR]阳性）替代定义BLBC，与使用GEP分析相比较，IHC替代因子敏感性为76%～79%，特异性为72%～100%【13,14】。由此可见，IHC定义BLBC并不准确，建立准确的IHC替代已成为热点。越来越多的研究关注IHC替代因子，如CK5/6或CK17【15】、CK5/6或P-钙黏着蛋白（钙黏素）【16】、CK5/6或CK14【17】均提示基底样分化，不同的因子具有不同程度的准确性。EGFR和CKIT【13】同样与BLBC相关。另外一些标志物如p63、平滑肌肌动蛋白（SMA）、陷窝蛋白和周期蛋白E也越来越多的被提出，尽管这些因子没有被纳入最新的美国临床肿瘤学会（ASCO）指南，但它们对辅助分型、预后评估和治疗都有重要作用。在此简要地回顾几种较为重要的基底样标志物。

　　一、αB-晶体蛋白

　　α-晶体蛋白基因包括2种：αA和αB。人类αB基因位于第11号染色体，编码175个氨基酸残基蛋白。αA-晶体蛋白主要存在于晶状体，其他组织中数量极少。αB-晶体蛋白蛋白则普遍存在【18-20】。过去10年研究发现，αB-晶体蛋白高表达于神经系统疾病（如亚历山大病【21】、帕金森病【22】）及其他疾病（如脑恶性肿瘤、肾细胞癌和乳腺癌相关疾病）。αB-晶体蛋白是小热休克蛋白家族成员，它通过双重职能保护细胞免受损伤，一方面作为分子伴侣维持蛋白质内稳态，另一方面通过抑制胱天蛋白酶-3活化和氧化应激防止细胞死亡【23-27】。近年来研究显示，αB-晶体蛋白可以抑制细胞失巢凋亡，提高内皮细胞/星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型渗透能力，诱导免疫缺陷小鼠TNBC向肺和脑转移【28,29】。在乳腺癌中，无论在蛋白还是基因水平，αB-晶体蛋白尤其与TNBC密切相关，而在正常乳腺组织、乳腺增生性病变及乳腺原位癌中，αB-晶体蛋白仅表达于肌上皮细胞。近来已普遍使用IHC方法检测BLBC和TNBC中αB-晶体蛋白的表达，其在BLBC中表达率为45%～56%。αB-晶体蛋白的高表达（68%）也可见于化生性癌【30】，表明αB-晶体蛋白在肿瘤亚分型上是具有高度敏感性和特异性的标志物【31,32】。基因芯片技术显示αB-晶体蛋白在BLBC中能够持续性表达【33】，其表达揭示该肿瘤对新辅助化疗不敏感且预后较差【34,35】。通过对855例有首次转移部位资料的乳腺肿瘤患者行全基因表达检测【36】，发现αB-晶体蛋白可以作为一种独立的预测因子，该因子阳性患者更容易出现脑转移，且阳性脑转移患者比阴性患者预后差【32,33】。

　　二、叉头蛋白转录因子C1

　　叉头蛋白转录因子C1（FOXC1）是FOX家族成员中的一种转录因子，同家族其他成员一样，其表达与多个器官的正常发育密切相关【37-42】。此外，FOXC1通过Notch-VEGF信号通路在血管的形成和成熟过程中发挥重要作用【43,44】。FOXC1的异常表达与多个脏器肿瘤相关，包括乳腺、肝脏、前列腺、脑、肺、结肠、胰腺、皮肤、宫颈、卵巢、口腔、血液系统和神经系统，揭示该因子在肿瘤发生过程中占据重要地位。FOXC1表达于正常乳腺终末导管小叶单位和导管原位癌的肌上皮细胞，在部分TNBC中也有表达，且FOXC1核阳性表达与TNBC密切相关【45】。在乳腺癌中，FOXC1过表达预示患者预后较差【46,47】。有报道显示FOXC1可通过增强基底样标志物P-钙黏着蛋白表达及降低上皮标志物E-钙黏着蛋白表达诱发上皮间质转化（EMT），尤其在MDA-MB-231BLBC细胞中FOXC1过表达（包含中等水平的内源性FOXC1），由此增强乳腺癌增殖、迁移和侵袭，这些数据均表明FOXC1能够诱发BLBC细胞侵袭性表型【48,50】。

　　进一步的研究发现，FOXC1在BLBC呈现特异性高表达【48】。在一组乳腺癌研究中，FOXC1核强阳性表达见于TNBC，且该类TNBC表达基底样细胞角蛋白（CK5/6阳性和/或CK14阳性），而在非TNBC中不表达。FOXC1与基底样角蛋白的表达密切相关，在CK5/6和/或CK14阳性的TNBC中敏感性为81%，特异性为80%【51】。一项独立的甲醛固定、石蜡包埋乳腺癌样本研究显示，通过双重方法（IHC和/或荧光定量逆转录聚合酶链反应[qRT-PCR]）检测FOXC1表达可以准确识别BLBC（AUC=0.88），由此证实通过基因芯片（AUC=0.90）和qRT-PCR（AUC=0.88）检测FOXC1来识别BLBC优于PAM50基因检测，上述结果提示单独检测FOXC1表达能够较好的识别BLBC，且该因子可作为预测脑转移发生的一种标志物【52】。

　　三、EMT

　　EMT是指肿瘤性上皮细胞通过表型和分子的改变转化为具有间质分化或干/祖细胞表型的一种复杂的生物学过程。形态学上，EMT是由立方/柱状上皮细胞转变为细长、梭形和纤维母细胞样的间质细胞，分子方面表现为黏附性分子的丢失和间质细胞标志物的获得，如E-钙黏着蛋白表达的下降和N-钙黏着蛋白、波形蛋白和细胞蛋白酶表达的升高。EMT与细胞多能性、基底样谱系和治疗失败等因素有关【53】。新近的基因转录调节研究显示，来源于正常乳腺干细胞的基因表达特性与claudin低表达型肿瘤相似。EMT相关基因表达的改变与claudin低表达型肿瘤和化生性癌密切相关【47】。TNBC伴有EMT标志物（波形蛋白、SMA、N-钙黏着蛋白和钙黏着蛋白-11）表达上调，包括细胞外基质重塑和侵袭性相关蛋白（SPARC、层粘连蛋白和肌成束蛋白）过表达，同时上皮标志物表达下调（E-钙黏着蛋白和细胞角蛋白），这种现象优先在基底样表型乳腺癌中出现，由此将EMT与BLBC联系起来【54】。

　　1、E-钙黏着蛋白：是一种跨膜糖蛋白，该蛋白可与邻近上皮细胞分泌的同型分子构建成拉链式连接体【55,56】。E-钙黏着蛋白表达下调伴随N-钙黏着蛋白表达上调导致肿瘤细胞失黏附【57】，这种模式多在BLBC和HER2阳性肿瘤中出现【58】，BLBC显示N-钙黏着蛋白高表达，尤其在血管丰富区域【56,57】。N-钙黏着蛋白上调（间质标志物）及E-钙黏着蛋白表达减弱使肿瘤细胞运动能力提高，从而导致临床预后差【55,56】。细胞极性与细胞连接的缺失及上皮成分的分解促进癌的浸润和转移【59】。EMT时肿瘤细胞蛋白酶产物参与周围基底膜降解【56,60,61】，基质金属蛋白酶（MMP）14、MMP9和ADAMTS1的表达在肿瘤基底膜的降解和肿瘤细胞的浸润中发挥作用【60-63】。

　　2、波形蛋白、ZEB1及Sip1：波形蛋白在TNBC中的表达高于非TNBC【64】。波形蛋白、Sip1和ZEB1在BLBC中表达高于非基底样TNBC。非TNBC中3种因子的表达与患者临床病理学特征无相关性，而在TNBC患者中，波形蛋白表达提示肿瘤细胞分化较差。对于ZEB1因子，肿瘤细胞中的表达与该肿瘤高的组织学级别、血管侵犯和高T分期相关，而间质细胞中的ZEB1表达与该肿瘤淋巴管和血管侵犯相关。Sip1核的高表达是无病生存的一种不利的预后因素。以上研究结果均提示EMT与TNBC，尤其是BLBC密切相关【65】。近年来研究表明EMT相关因子（波形蛋白、SMA、骨粘连蛋白、N-钙黏着蛋白表达；E-钙黏着蛋白缺失），EMT诱导因子（ZEB1和CD146）及乳腺癌干细胞标志物（CD44阳性/CD24阴性和ALDH1）与TNBC临床病理学特征和预后相关。波形蛋白、CD44阳性/CD24阴性和CD146在基底样TNBC中的表达高于非基底样TNBC，CD146表达与EMT相关标志物和CD44阳性/CD24阴性密切相关，而ZEB1表达只与SMA相关。波形蛋白、SMA、骨粘连蛋白和ZEB1的表达和E-钙黏着蛋白缺失最常见于化生性癌。生存分析显示，EMT相关标志物与患者的临床预后无相关性。然而，ZEB1的表达提示患者无病生存期短，是一种独立的预后因子。这些发现揭示了EMT相关因子的表达可以预示TNBC特定亚型，如化生性癌；ZEB1是预测TNBC预后的潜在生物标志物【66】。

　　四、雄激素受体

　　雄激素受体（AR）是甾体类激素受体家族成员，其基因定位于X染色体q11-12。AR表达于正常乳腺组织大汗腺化生细胞，可能是乳腺癌中最常表达的甾类激素受体，表达率为60%～89%【67-70】。回顾性研究发现AR在ER阳性和ER阴性转移性乳腺癌中的表达具有不同的预后意义。在ER阳性乳腺癌中，AR表达见于67%～88%的病例【70-72】，其表达与低病死率相关【72】。在ER阴性乳腺癌中，AR表达见于12%～50%的病例，主要在分子大汗腺型乳腺癌中高表达【72-74】，且与低存活率相关【70,75】。TNBC中，AR表达率为10%～32%【76,77】，这些病例可被划分为独特的管腔雄激素受体（LAR）亚型。LAR亚型激素调节信号通路和雌/雄激素代谢信号通路不同于其他亚型肿瘤，DNA拷贝数分析显示LAR亚型肿瘤生物学行为也不同于TNBC其他亚型【78】。鉴于LAR亚型独特的生物学途径，其治疗理论上优先选用管腔雄激素阻断，并有望成为LAR肿瘤治疗的靶点。

　　一项Ⅱ期临床试验评估了比卡鲁胺（一种AR阻断剂）的效果，424例TNBC患者中51例（12%）AR阳性，AR阳性患者临床获益率（CBR）为19%，支持雄激素阻断在临床上可用于AR阳性TNBC【73】。另一项关于恩他沙胺（另一种AR抑制剂）的试验中【79】，75例AR阳性（AR≥10%）晚期TNBC患者的CBR为35%。此外，56例AR阳性分子特征患者的CBR为39%，而62例阴性特征患者的CBR为11%。这两项研究提供了AR阻滞使AR阳性TNBC患者临床获益的证据。除此之外，AR阳性TNBC患者常会出现PIK3CA基因突变，此时PI3K抑制剂在治疗AR阳性的TNBC时可能更加有效【80】。PI3K抑制剂和AR阻滞联合治疗将会成为今后研究的重点。

　　五、肿瘤浸润淋巴细胞及相关标志物

　　新近，免疫系统对肿瘤应答反应和预后的影响成为研究热点，免疫系统调控治疗已被用于临床。研究显示，肿瘤内或肿瘤周围淋巴细胞浸润是临床预后的重要标志物【81】。免疫细胞浸润最常见于TNBC和HER2阳性乳腺癌【82】，且肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）水平增高提示预后良好，在TNBC中尤其是这样【83,84】。在HE染色切片中观察TIL很容易，肿瘤中TIL可分为肿瘤周边间质组织内淋巴细胞浸润（间质TIL）和肿瘤巢内淋巴细胞浸润（肿瘤内TIL），二者水平高度相关，对铂类新辅助化疗药物病理完全缓解（pCR）有一定预测价值【85】，并且是TNBC良好的预后因素【86】。新近一项荟萃分析纳入2987例早期乳腺癌，中位随访时间超过113个月，发现肿瘤TIL增高能够降低患者30%复发风险、22%远处转移率和34%的病死率。此外，TIL每增加10%，复发、远处转移或病死率降低约15%～20%【86】。另一项荟萃分析纳入25个已发表的研究，22964例患者的资料表明TIL不是提示乳腺癌总体人群无病生存率和总生存率的预后标志物，但可以改善TNBC患者的无病生存率（HR=0.82；95%CI=0.76～0.88）和总生存率（HR=0.79；95%CI=0.71～0.87）【87】。HE诊断中推荐以连续变量评估间质TIL，因其具有更好的再现性。新近出版了一项更为标准化的评分方法详细指南【88】可供参考。TIL由不同的淋巴细胞亚群组成，其中T细胞占主导优势（75%），还包含少许B细胞和自然杀伤细胞【89】。TIL亚群中，CD8阳性淋巴细胞能够改善乳腺癌整体人群的无病生存率（HR=0.69；95%CI=0.56～0.84）和乳腺癌特异性生存率（HR=0.78；95%CI=0.71～0.86），而FOXP3阳性淋巴细胞能够降低患者的无病生存率（HR=1.47；95%CI=1.01～2.05）和总生存率（HR=1.50；95%CI=1.15～1.97）。在ER阴性肿瘤中，CD8阳性淋巴细胞也能够改善患者的特异性生存期。TIL和TIL亚群有望成为乳腺癌，特别是TNBC的预后相关标志物【87】。

　　TIL与新辅助化疗应答反应也具有相关性【90】。TIL与TNBC的强相关性揭示该亚型有免疫系统积极参与，这一点为TNBC免疫治疗提供了强有力的支持。程序性死亡分子1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）位点拮抗剂对乳腺癌的治疗已在测试阶段。已有2项临床试验评估了TNBC患者PD-1/PD-L1阻断的功效，一项Ⅰ期研究显示，在至少5%肿瘤表达PD-L1的21例患者中应用抗PD-L1抗体MPDL3280A，总缓解率为19%【91】。另一项纳入32例晚期TNBC患者的Ⅰ期临床试验，对肿瘤内或间质中淋巴细胞PD-L1着色的肿瘤使用MK-3475，总缓解率为18.5%（27例患者中有5例可评价）【92】。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌中PD-L1过表达与使用PD-1/PD-L1阻断剂获得良好缓解显著相关。然而，在这2项小样本量乳腺癌研究中，没有发现高水平PD-L1与改善缓解率的相关性【92】。目前，尚没有建立PD-L1作为预测指标的标准化评估方法，不同的试验使用不同的截断值和抗体。PD-L1表达是一个动态过程，因此单个时间点的评估可能无法反映演进过程的免疫应答反应【93】。

　　六、Ki-67

　　Ki-67是一种增殖核抗原，表达于细胞周期的各个阶段，包括G1、S和M期，但G0期不表达。在乳腺癌中，高Ki-67指数通常提示更高的组织学级别，生物学行为更具有侵袭性，但该类肿瘤可能对化疗更敏感【94】。由于临床评估重复性差、肿瘤的异质化、评估方法有效性的变化及不同类型标本缺乏标准化（如穿刺标本、肿瘤完整切除标本、组织基因芯片标本），目前Ki-67没有标准的截断值来区分“高Ki-67”与“低Ki-67”【95】。高Ki-67标志物的阈值范围为3.5%～35%【96】，常用的截断值包括10%【97】、14%【98】和20%【4】。在对357例患者PAM50内在亚型分型研究中，作者提出14%可作为区分管腔A型与管腔B型乳腺癌的截断值，尽管分类错误率高达25%【98】。一般来讲，TNBC中Ki-67的表达高于非TNBC【99】，Ki-67可能有助于将不同化疗反应的TNBC进一步分类，对于非病理完全缓解患者，治疗后Ki-67的显著降低可提示良好的预后【100】。

　　七、结论

　　乳腺癌存在显著异质性，在不同肿瘤类型中，TNBC的治疗仍然具有挑战性，因其对常用的激素治疗和HER2靶向治疗不敏感。即使在TNBC组内，也存在具有不同生物学行为和预后的不同亚型。在个体化治疗和特定靶向治疗的时代，TNBC及其特定亚型缺乏显著和明确的靶点，使得这些肿瘤成为深入研究的主题。目前有许多潜在标志物，其中一些有望成为治疗的潜在靶点。已经发现αB-晶体蛋白是BLBC和TNBC的特异性标志物，其表达与患者化疗拮抗性和预后较差相关。FOXC1是BLBC高度敏感和特异的IHC标志物，并且与乳腺癌患者的不良预后相关。EMT途径可能在TNBC中激活，导致EMT因子（波形蛋白、SMA、N-钙黏着蛋白和钙黏着蛋白-11）上调，参与细胞外基质重塑和浸润相关蛋白过表达（SPARC、层粘连蛋白和肌成束蛋白）和降低上皮标志物（E-钙黏着蛋白和细胞角蛋白）表达，这些改变也与TNBC患者的不良预后相关。AR在乳腺癌中常表达，但是不同ER状态的肿瘤预后不同。在ER阳性乳腺癌中，AR表达与预后良好相关，而在ER阴性乳腺癌中，AR表达与预后不良相关。因此，AR是治疗TNBC及其他ER阴性乳腺癌的潜在靶点。TIL在TNBC治疗中的研究令人兴奋，强有力且统一的证据表明TNBC患者TIL增加能够极大的改善预后，更重要的是，生存获益似乎以剂量依赖性方式随TIL增加。进一步的临床试验正在进行中，其中一些标志物药物靶点极有可能成为我们对抗乳腺癌的武器。

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原文参见：中华病理学杂志. 2017;46(1):2-8.