不同来源鼠伤寒沙门菌的侵袭力及毒力基因表达

不同来源鼠伤寒沙门菌的侵袭力及毒力基因表达

戴 随

（天津市第五中心医院检验科，天津 300450）

摘要：目的探讨不同来源的鼠伤寒沙门菌侵袭力和毒力基因表达的差异。方法从腹泻患者粪便﹑河水及土壤中共分离出鼠伤寒沙门菌（分别简称为临床株﹑水体株﹑土壤株）34株，分析菌株在上皮细胞黏附﹑侵袭以及巨噬细胞内复制能力的差异；选择与黏附﹑侵袭以及复制阶段相关的毒力基因（鞭毛合成位点filC，致病岛1位点hilA﹑invI，致病岛2位点ssrA﹑sseF），通过实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测不同来源细菌的毒力基因表达差异。结果土壤株和水体株的黏附力和侵袭力与标准菌株（ATCC 14028）类似，但80%左右的临床株表现出比标准菌株（ATCC 14028）更高的黏附力和侵袭力。在巨噬细胞内的复制结果显示，临床株﹑土壤株以及水体株的胞内复制能力均与标准菌株（ATCC 14028）类似。不同菌株的毒力基因表达情况与细胞黏附﹑侵袭及胞内复制结果相吻合。高侵袭力临床株在黏附期filC基因以及侵袭期hilA﹑invI基因的表达量显著高于标准菌株（ATCC 14028）（P＜0.05），而胞内复制期ssrA和sseF基因的表达量与标准菌株（ATCC 14028）类似。土壤株和水体株在不同时期的基因表达量均与标准菌株（ATCC 14028）类似。结论鼠伤寒沙门菌临床株显示出较环境菌株更强的黏附力﹑侵袭力及更多的相应毒力基因表达量，应着重加强对医院内沙门菌感染的防控措施，降低医源性沙门菌的感染率。

关键词：鼠伤寒沙门菌；侵袭力；毒力基因表达

鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患致病菌，广泛寄生于人和动物肠道内。其通过粪口途径传播，主要引起肠胃炎，在免疫功能低下的个体如老人和小孩中能引起全身性中毒症状，严重者可致死[1]。鼠伤寒沙门菌的致病过程分为肠道感染和细胞内感染2个阶段：细菌黏附并侵入小肠上皮细胞，为肠道感染阶段；细菌进入上皮细胞或巨噬细胞内，然后在胞内复制，为细胞内感染阶段。其致病能力与多种毒力因子相关，包括致病岛1﹑致病岛2﹑鞭毛﹑菌毛等[2]，其中影响入侵过程的主要毒力因子为致病岛1，影响胞内复制的主要毒力因子为致病岛2[1-2]。

致病菌毒力强弱与细菌来源相关[3-4]。目前，针对沙门菌来源与其致病性之间关系的研究报道甚少。本研究以分离自腹泻患者粪便﹑土壤以及河水的共计34株鼠伤寒沙门菌为研究对象，分析菌株在黏附﹑侵袭﹑胞内复制以及毒力基因表达方面的差异，为进一步研究鼠伤寒沙门菌的致病特性提供新的实验数据，以期为更好地防控沙门菌感染提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 菌株与细胞系

研究对象为分离得到的34株鼠伤寒沙门菌，其中包括从医院腹泻患者粪便中获得的18株（简称临床株，L1～L18），从市内海河水中分离的10株（简称水体株，S1～S10），从土壤中分离的6株（简称土壤株，T1～T6）。所有入选菌株均与O∶4单价血清进行抗血清凝集试验从而被重新鉴定。鼠伤寒沙门菌标准菌株（ATCC 14028）购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），由检验科保存。人结肠癌细胞系Caco-2和鼠巨噬细胞系J774A.1购自上海中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂

用于细胞培养的RPMI-1640培养基﹑胰酶和胎牛血清购自Gibco公司，用于RNA提取的Trizol购自Invitrogen公司，RNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司，cDNA反转录试剂盒及SYBR Green Mix购自TaKaRa公司，24孔细胞培养板购自Corning公司。

1.3 主要仪器

恒温CO2细胞培养箱购自Thermo公司，7500荧光定量PCR仪购自ABI公司，高速冷冻离心机购自Eppendorf公司，NanoDrop 2000分光光度计购自Thermo公司，凝胶成像系统购自Tanon公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 细胞采用RPMI-1640培养基，补充10%的胎牛血清，于37 ℃恒温培养箱中传代培养。当培养瓶中细胞生长到80%以上时，用胰酶消化，之后将细胞均分于24孔细胞培养板内继续孵育约24 h，待细胞铺满各培养孔后直接用于后续试验。

1.4.2 黏附力及侵袭力检测 细菌对上皮细胞的黏附力及侵袭力检测参照ISBERG等[5]报道的方法进行。收集对数中期的细菌，用RPMI-1640培养基重悬，采用平板计数方法计算初始菌量。细菌按照感染复数（细菌∶细胞）为10加入至细胞培养板中，以1 000×g离心5 min，在37 ℃﹑5% CO2恒温培养箱中共培养1 h。吸去菌液，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，加入0.1% 十二磺基硫酸钠裂解细胞，在裂解液梯度稀释后涂板并计数。细菌黏附率=黏附细菌数/每孔中加入的细菌数×100%。侵袭力检测方法基本同上。细菌与细胞共培养1 h，吸去菌液并用PBS洗3次，然后在含细菌和细胞的24孔板中加入含有50 μg/mL庆大霉素的培养基，继续培养1 h，以便杀死未进入细胞的细菌。裂解细胞，稀释后涂平板并计数。细菌侵袭率=细胞内细菌数/黏附细菌总数×100%。

1.4.3 复制能力检测 菌株在巨噬细胞内的复制能力检测参照SITTKA等[6]报道的方法进行。收集对数中期的细菌，用RPMI-1640培养基重悬，按照感染复数为10加入至细胞培养板中，以1 000×g离心5 min，在37 ℃﹑5% CO2恒温培养箱中共培养30 min。用PBS洗3次以便洗掉未被吞噬的细菌，此时的时间点为T0。在含细菌和细胞的24孔板中加入含有50 μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基，于37 ℃﹑5% CO2恒温培养箱中继续孵育1 h，裂解部分细胞，涂板并计数细菌，此时（T1）的细菌数目为初始胞内菌量。将培养基换成新的含10 μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基，继续孵育23 h，裂解剩余细胞，涂板并计数此时（T24）的胞内菌量。细菌复制力=T24胞内菌量/初始胞内菌量。

1.4.4 实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 根据Invitrogen公司提供的说明书提取各测试样本的RNA。用RNA纯化试剂盒纯化RNA样本，纯化后进行反转录。用反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，反应在7500荧光定量PCR仪上进行。用Primer premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR的引物，引物由生工生物（上海）有限公司合成，序列见表1。以16S rRNA作为内参基因。以2-ΔΔCt方法计算基因的差异表达倍数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计分析。用3次数据的平均值计算误差条，并采用独立样本t检验进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黏附力差异

受试菌株对Caco-2细胞的黏附结果显示，临床株的黏附力显著高于水体株和土壤株。土壤株和水体株的黏附力均与标准菌株（ATCC 14028）类似，黏附率约为25%；而在18株临床株中，有14株菌株的黏附率＞35%，占受试临床株总数的78%，黏附力明显高于标准菌株（ATCC 14028）（P＜0.05）。见图1﹑图2。

表1 本研究所用的引物序列

基因名称 基因功能 序列（5'～3'） 扩增长度（bp）16S rRNA 管家基因 F：CGGGGAGGAAGGTGTTGTG 180 R：GAGCCCGGGGATTTCACATC fi lC 鞭毛调控基因 F：CCTCGGCTACTGGTCTTGGT 152 R：AAGAGTCACCTCACCGTTCGT hilA SPI-1调节基因 F：TCCACGCAGGAAATAACAGG 203 R：TGGGCAACCAGCACTAACG invI SPI-1入侵基因 F：GGCGATCCTTGAACAAATAGC 145 R：CGGCGAACAATAGACTGCTT ssrA SPI-2调节基因 F：GCTTTCCTTTATACCCAACCC 169 R：GGAAGTTTAACCGTCACCTCA sseF SPI-2效应蛋白基因 F：GACAGTCGTGTTTGGGTTATCG 136 R：CTGGCGGTTTGTAATGGCTC

图1 鼠伤寒沙门菌对Caco-2细胞的黏附率

图2 典型鼠伤寒沙门菌的细胞黏附图

注：（a）ATCC 14028；（b）L12；（c）Caco-2细胞；（d）S6；（e）T4；（f）Caco-2细胞

2.2 侵袭力差异

临床株的侵袭力明显高于水体株和土壤株。土壤株和水体株的侵袭力均与标准菌株（ATCC 14028）类似，侵袭率约为46%；15株临床株的侵袭率＞55%，占受试临床株总数的83%，侵袭力明显高于标准菌株（ATCC 14028）（P＜0.05）。高侵袭力与高黏附力无直接关联，如临床株L13﹑L17黏附力不强，但表现出较高的侵袭力；L4﹑L11侵袭力不强，但有较高的黏附力。见图3。

2.3 在巨噬细胞内的复制能力差异

对受试菌株在巨噬细胞内的复制能力进行检测后发现，3种不同来源的受试菌株都表现出与标准菌株（ATCC 14028）相似的复制能力，说明这3种细菌来源对细菌的胞内复制未产生影响。见图4。

图3 鼠伤寒沙门菌对Caco-2细胞的侵袭率

图4 鼠伤寒沙门菌的复制能力

2.4 毒力基因表达情况

分别选择鞭毛合成相关位点filC，致病岛1位点hilA﹑invI和致病岛2位点ssrA﹑sseF检测不同时期不同菌株毒力基因的表达情况。随机选择水体株S6﹑土壤株T2﹑黏附力及侵袭力均增强的临床株L8和L12进行实时荧光定量PCR，以标准菌株（ATCC 14028）作为对照菌株。土壤株及水体株在各个时期的毒力基因表达情况均与标准菌株（ATCC 14028）类似。临床株L8和L12在黏附期filC基因以及侵袭期hilA和invI基因的表达量显著高于标准菌株（ATCC 14028）（P＜0.05），而胞内复制期ssrA和sseF基因的表达量与标准菌株（ATCC 14028）类似，因此临床株的基因表达结果也与之前的黏附﹑侵袭和胞内复制试验结果相吻合。见图5﹑图6。

图5 各菌株毒力基因表达的差异

注：fi lC；hilA；invI；ssrA；sseF

图6 invI及hilA基因电泳图片

注：1为ATCC 14028；2为临床株L8；3为临床株L12；4为水体株S6；5为土壤株T2

3 讨论

沙门菌严重威胁人类健康。据美国疾病预防控制中心最新调查发现，在美国，沙门菌每年可导致约150万的食物中毒病例，造成26亿～146亿美元的经济损失[7]。在发展中国家，因人口众多﹑卫生医疗条件不完善等原因，其造成的损失远远高于美国。鼠伤寒沙门菌作为沙门菌的典型血清型，深入研究其致病特性对沙门菌属的治疗及防控具有重要的指导意义。

本研究表明，临床株的黏附力及侵袭力显著高于水体株和土壤株，与黏附及侵袭相关的毒力基因表达量也显著高于水体株及土壤株。相似的结果在其他研究中也被报道。非致病性的大肠埃希菌在经历巨噬细胞内的多代选择后，其对抗巨噬细胞吞噬的能力以及对小鼠的致病能力均得到显著提高[8]。由此推测本研究临床株侵袭力的提高可能与其经历宿主肠道内的选择压力相关。肠道内的高渗透压及低氧信号均能诱导沙门菌对肠道上皮细胞的入侵[9]。临床株离开宿主后，可能仍保持被诱导的状态。从长期进化水平来讲，宿主压力可能导致毒力基因或毒力调控基因的单核苷酸多态性发生变化或在某些表观遗传学上产生差异，从而导致毒力基因的表达增强。由于单核苷酸多态性是多种多样的，因此对于同一种临床株来讲，有可能是鞭毛基因的变化，也有可能是入侵相关基因的变化，还有可能是二者同时发生变化，所以本研究中同一临床株的高侵袭力与高黏附力并不直接相关。

在巨噬细胞内的生存复制是沙门菌开启胞内感染的必要阶段，也是细菌导致系统性伤寒症的必要条件[10]。在本研究中，临床株并未表现出较环境株更高的胞内复制能力，这说明临床株的高毒力仅限于肠道感染阶段，此结果也可能与鼠伤寒沙门菌本身的致病特性相关。鼠伤寒沙门菌在免疫功能健全的成人中一般不引起系统性疾病[11]，而在巨噬细胞内的复制能力是与系统性疾病相关的[2]。鼠伤寒沙门菌在人体内可能没有经历过在巨噬细胞内对其复制相关基因的诱导阶段。

总之，本研究发现临床株表现出较环境株更高的侵袭力和毒力基因表达能力。这一结果提示我们应该重点加强医院内菌株的控制，在腹泻患者集中的住院区域，加强患者用品﹑食物的卫生管理及卫生宣传工作，防止再度发生医源性沙门菌感染。

参考文献：

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[6] SITTKA A，PFEIFFER V，TEDIN K，et al. The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence of Salmonella typhimurium[J]. Mol Microbiol，2007，63（1）：193-217.

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Invasion abilities and the virulence gene expressions of Salmonella typhimurium with different origins

DAI Sui.
（Department of Clinical Laboratory，Tianjin Fifth Central Hospital，Tianjin 300450，China）

Abstract：ObjectiveTo analyze the difference of invasion abilities and the virulence gene expressions of Salmonella typhimurium with different origins.MethodsA total of 34 isolates of Salmonella typhimurium were collected from soil（strains from soil），water（strains from water） and patients with diarrhea（clinical strains），and their abilities of attachment and invasion to epithelial cells and abilities of replication in macrophages were compared. Real-time fl uorescence quantitation polymerase chain reaction（PCR） was used to determine the virulence gene expressions of Salmonella typhimurium with different origins. The virulence genes，including fl agella locus filC，Salmonella pathogenicity island-1 loci hilA and invI，and Salmonella pathogenicity island-2 loci ssrA and sseF，were determined.ResultsThe attachment and invasion abilities of strains from soil and water were comparable to those of standard strain（ATCC 14028），while about 80% clinical strains exhibited higher attachment and invasion abilities to epithelial cells. Macrophage replication assay showed that all the strains showed comparable replication ability with that of standard strain（ATCC 14028）. The expression patterns of virulence genes in different strains were highly consistent with the results of the attachment and invasion abilities and the replication abilities in macrophages. In line with the results of invasion ability，clinical strains showed high filC，hilA and invI gene expressions relative to that of standard strain（ATCC 14028）（P＜0.05），while the gene expressions of ssrA and sseF were not altered. Strains from soil and water showed comparable expression of all the determined genes to that of standard strain（ATCC 14028）.ConclusionsClinical strains exhibit higher invasion ability and virulence gene expression than those of environmental strains，and the controlling for clinical strains should be highlighted to prevent from nosocomial infection.

Key words：Salmonella typhimurium；Invasion ability；Virulence gene expression

文章编号：1673-8640（2017）02-0071-05

中图分类号：：R446.5

文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.02.001

（收稿日期：2016-04-28）

（本文编辑：姜 敏）

作者简介：戴 随，男，1983年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验诊断学研究。