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蒋永亮，湖南省人民医院 医学博士、硕导、主任医师 肺部感染性疾病是较为常见的呼吸科疾病，肺部感染后常会导致肺间质、肺泡以及肺部终末气道出现炎症，临床常表现为咳嗽、发热以及寒战等。然而随着医学的不断发展，引起肺部感染的病原体也在不断变化，致病因素复杂，临床表现多样。快速、全面、准确地鉴别病原体是临床医生及时、有针对性地采取治疗措施的前提。传统的病原体检测方法目标单一、耗时长、操作复杂，很难满足当今感染性疾病诊治的要求，二代测序技术的出现与快速发展将为肺部感染性疾病的诊断与治疗提供更有力的技术支持。 1、二代测序技术简介 1977年Frederick Sanger发明了轰动一时的双脱氧链终止法核酸测序技术，开启了基因测序的先河，sanger测序法则被称为第一代测序技术，因其测序准确性高、读长较长的特点在人类基因组计划及相关科研领域的研究中取得了重大成就，但同时它也存在测序反应时间较长、测序通量低、成本高的缺点。 因而在2005年基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统被报道，开创了NGS（next-generation sequencing, NGS）的先河，它以高通量、低成本、短用时、高度自动化著称[1]。NGS技术的核心思想是边合成边延伸边测序, 通过捕捉合成链末端的信号 (荧光信号或氢离子释放所致的pH值变化) 来获得DNA序列信息，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测的序列信息。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术成为第二代测序技术的主要标记技术。 1.1 Roche 454技术 Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。其主要测序原理是：（1）DNA文库制备 利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库。（2）Emulsion PCR 454技术将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。其基本过程是在PCR反应前，含PCR所有反应成分的水溶液注入高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴，即独立的PCR反应空间。小水滴里的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，可与单链DNA序列特异结合。而孵育体系中含有PCR反应试剂，使得每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。（3）焦磷酸测序 测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上来固定每个磁珠的位置，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果，根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而454技术干扰和测序偏差较小。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，而它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度。 1.2 Solexa，Hiseq技术 Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理都是边合成边测序，主要过程分4步：（1）DNA待测文库构建 利用超声波把待测的DNA样本打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。（2）Flowcell Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。1个Flowcell有8个channel，每个channel的表面上的每个接头都能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。（3）桥式PCR扩增与变性 桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝。（4）测序 向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP，在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团。该技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间。 1.3 Solid测序技术 Solid测序技术是基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。它的原理是：（1）DNA文库构建 将片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。（2）Emulsion PCR 与454的方法类似，但Solid采用的小水滴仅1um，在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，3’修饰的微珠在玻片上沉积。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。（3）连接酶测序 这一步是Solid测序的独特之处。它采用的是连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，是目前第二代测序技术中准确性最高的。 2、二代测序技术在肺部感染性疾病的应用 2.1 NGS在肺部病原体感染检测中的应用 目前，基于培养的病原学诊断学方法仍然是诊断肺部感染性疾病病原学诊断的主要手段，主要依靠临床微生物实验室的培养结果，但是也很大程度上受培养条件和抗生素使用等影响，且培养阳性率低，尤其是在有基础疾病或免疫抑制状态的人群中[2.3]。 对于肺部感染，二代测序技术可用于多种病原体的检测，如细菌、真菌、病毒、支原体等病原体，也可用于多种呼吸系统标本的检测，如痰液、咽拭子、肺泡 灌洗液等标本，并与传统微生物技术相比表现出了良好的诊断性能。[4.5］ 潘阳等[6]选择 2014～2016 年严重急性呼吸道感染病例，分离出A（H3N2）亚型流 感病毒毒株32株，提取病毒RNA，然后用二代测序仪进行了病毒全基因组测序，并对毒株各个基因进行了分子进化分析和分子特征分析。LI Qian等[7]应用采用靶向序列富集与二代测序相结合的方法 ( 即 Ampliseq 法)，建立了可同时检测4种常见血流感染病原体的目标片段特异性富集结合二代测序的方法，与传统单重PCＲ方法相比，不仅减少了样本核酸需求量，扩大了检测范围，并具有较好的特异性及灵敏度，为血流感染病原体的快速准确检测 提供了新技术，为临床快速用药提供了科学依据。 对于有基础疾病或免疫抑制状态的人群，肺部感染的发生率可想而知比正常人群更高。Parize 等[8]的一项多中心前瞻性研究，对比了二代测序技术mNGS与传统微生物方法学 (血培养、血清学诊断，抗原抗体检测，PCR等)在检测疑似感染的免疫缺陷患者病原菌方面的可靠性。该研究结果显示与常规微生物方法相比，二代测序mNGS技术较传统培养法有较高的检出率，且有更高的阴性预测值。二代测序对病原体的覆盖面广，可检测涵盖细菌、病毒、真菌和寄生虫几千种病原微生物，对标本类型覆盖面广，囊括了血液、肺泡灌洗液、脑脊液等多种标本类型。因此，非靶向的新一代测序对于免疫受损成人微生物诊断将有更大的获益。缪青等[9]一项研究表明呼吸道病毒感染的患者多合并免疫损伤因素，无偏倚的微生物宏基因二代测序技术在敏感性及准确性方面与传统的病毒检测技术均具有可比 性 。ｍNGS理论上揭示了样本中所有的微生物信息，可检测出更多的病毒类型，阳性率更高。 可检测 出的病毒包括熟知的上呼吸道病 毒，免疫抑制宿主的下呼吸道病毒如HSV及 CMV。在血液科，我们总是能看到许多在骨髓抑制期，因其免疫力较正常人明显低下，而深受呼吸道病毒感染毒害的血液系统恶性肿瘤患者。有研究表明，呼吸道病毒感染（RVI）是血液系统恶性肿瘤和造血干细胞移植（HSCT）的重要共病，其共病率高达30％[10]。Kothari A等[11]利用在骨髓瘤患者中发现的13例HPIV3感染病例，利用NGS技术，跟踪呼吸道病毒感染爆发，明确区分了感染爆发期间获得的分离株的相关性，并为传播途径提供证据，得出NGS作为一种流行病学工具，具有较高的价值，可用于收集实时信息和确定传播联系，以帮助免疫功能低下患者预防感染的结论。 随着基于二代测序技术鉴定病原体的范围越来越广，发现病毒在呼吸道感染中的比例比以往想象得多，研究表明，在呼吸道标本检测到的病毒种类中，约30.2％为常见的呼吸道病毒，14％为非呼吸道 病毒，55.8％为非人类病毒[12]。 病毒性病原体的检测主要包括病毒抗原检测、核酸检测以及病毒分离培养等，然而传统的病毒病原体总存在其固有的缺陷，目前，应用ｍＮＧＳ检测病毒感染的优势性已得到国际诸多同行的肯定，应用ｍＮＧＳ技术对院内获得性病毒性肺炎进行实时快速的检测，多项研究表明二代测序技术较传统方法更快地获知证据，从而及时采取措施控 制院内感染的暴发［13.14］。朱小娟等[15]对1例不明原因肺炎患者进行病原学诊断, 采集患者的咽拭子标本,提取DNA，采用多种高通量 测序技术进行检测，最终得出结论，该患者的肺炎由腺病毒B组55型感染引起,该病毒由HAdV-11与HAdV-14重组产生。Stevenson JB 等用此技术建立同时检测流感病毒A、流感病毒B和呼吸合胞病毒的方法，对30个阳性样本的检出率达93%，另外两个样本因样本量过少而未能检出，此方法的建立和有效检测丰富了多病原体同时检测的方法[16]。在2015年Xie等[17]对中国首例引起中东呼吸综合征的新型人冠状病毒的研究也进行了基因组测序，尝试从基因的角度发现其致病机制，为中东呼吸综合征的防治奠定了基础。 真菌感染也是威胁人类健康的一大疾病，尤其是肺部真菌感染，有致死性高、诊治难度大的特点，这种种难题都提示着我们迫切需要一种新方法更准确、快速地辅助临床诊疗。长期以来，培养在真菌感染的诊断中都占据着主导地位，但传统方法存在其在鉴别混合感染以及分析菌群群落结构和动态变化中灵活度不够的固有缺陷，很多真菌或者未被发现的新菌种，很难甚至无法被培养出来。［18］与细菌DNA提取方法不同，二代技术在真菌菌群结构谱方法主要是通过对真菌 ITS1（internal transcribed spacer）和 ITS2 基因片段进行扩增、测序、分析，利用ITS1/ITS2基因测序技术，一般可检测到50~60个菌属［19］，而且测序所得到的真菌 ITS 基因序列可以通过现有的基因数据库进行匹对，但其缺陷在于对于新物种，则无法准确地确定种类［20］，在 GeneBank 平台上，还有许多真菌 ITS 测序序列被定义为“unidentified fungus”。但对于目前在临床最常见的念珠菌属以及曲霉菌属，ITS 基因测序可以很好地识别它们的ITS基因序列，并且可在种水平区分出一些病原菌菌株［21］。近年来，少数研究利用二代测序技术，可检测到更为丰富的真菌菌群。据统计，利用454FLX 方法检测到的真菌菌群，超过60%的种属是培养技术无法检测到［22］。即使目前各个研究结果有所差异， 但共同一致的是念珠菌属丰度是最高的［22.23］。真菌可导致肺功能减退，影响疾病预后，而二代测序技术有助于从群落整体结构了解气道微生物的全貌以进一步辅助疾病的诊疗。 结核分枝杆菌在肺部感染的病原体中也占据了重要位置，自1998年全球第１株结核分枝杆菌标准菌株H37Rv全基因组测序(WGS)工作完成［24 ］ ，在此后的近十年中仅有９ 株结核分枝杆菌全基因组数据上传至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库。而二代测序技术的诞生使结核杆菌的病原体检测、流行病学及分型都产生了飞跃的进步。黄畅宇等通过利用NGS 技术检测支气管肺泡灌洗液最终对2 例可疑肺结核病及肺非结核分枝杆菌病的肺部感染患者进行了确诊[25]。加拿大的学者Gardy J L对３４株结核病社区暴发分离株进行流行病学研究［26］，全基因组序列分析发现 ，VNTR分型相同的３４株仍可分为基因型不同的２个簇 ，存在不同的传播源和传播路径 。借助二代测序技术 ，Reyes等［27］建立了ＩS6110RFLP高通量分型 方法 ，可同时对几百株结核分枝杆菌进行分型 ，极大提高了分型效率。Ｗalker， Ｍedini 等的相关研究也得出了同样的结论，在结核病流行病学研究领域，全基因组技术较先前的基因分型方法有优势[28.29]。 全基因组测序可确定传播链中各菌株间的变异 和传播源 ，且该方法目前已在多项结核病流行病学研究中使用[30.31]，并充分显示出其优势所在 。曾经结核分枝杆菌复合体（MTBC）中的遗传多样性程度一度引起了该领域激烈的争论，直到全基因组测序（WGS）应用于该领域，对MTBC菌株进行更新和更可靠的系统发育分析，发现菌株之间存在更多的遗传多样性，遗传距离有时与种间相当Mtb和M. bovis之间的距离[32.33]。 2.2 NGS在肺部不明病原体的溯源与监测中的应用 对于呼吸科医生来说，据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、准确的病原体检测方法，对有效诊断和及时控制感染性疾病具有重要的意义 [34]。总所周知，临床微生物实验室的荧光定量PCＲ技术对疑似病毒进行筛查和确认都必须建立在已知病原体基因序列基础上，而对于未知的病毒病原体则无法鉴定。而二代测序技术不仅可以发现己知病原体，而且可以发现完全未知的病原体，现代分子分型技术类型多种多样，而其中在感染性疾病溯源和监测中最常用的分子技术有多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE） 和多位点串联重复序列分析（MLVA）等，而新兴起的高分辨力的 WGS 技术为感染性疾病的准确溯源和监测提供了保障，还可以多项分子技术的联合使用进行优势互补提高检测的准确性。其中“PFGE”被誉为病原体分子分型的金标准[35]。而使用 ＷＧＳ技术可以追踪 病原体的流行情况以及更加准确地确定病原体可能的来源［36］。从而有效地控制病原体的散播和流行。且随着该技术的不断发展，目前对于不明病原体的溯源与监测能力越来越突出。 对病原体进行监测或鉴定主要是为了防范病原体的传播和指导临床诊疗。2010年英国一家医院在爆发鲍曼不动杆菌后， Lewis T等[37]利用全基因组测序鉴定出分离株中的单核苷酸多态性，这是该技术在医院获得性感染中消除流行病学关联最早的应用，随后，WGS在医院暴发的检测与溯源方面的应用越来越多起来， Harris SR [38] 等利用高通量基因组学方法，提供了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）的显性菌株的流行病学和微进化的高分辨率视图，ST239 在40年间的全球分布和种系发生，以及其在医院环境中人与人之间传播的潜力。该结果对感染控制具有重要意义，并为针对MRSA传播的干预产生了宝贵的信息。2011年，美国国立卫生研究院临床中心爆发了碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，Snitkin ES[39]等综合基因组测序技术和流行病学分析了肺炎克雷伯氏菌分离株，将爆发追踪至单个患者的三次独立传播，通过对基因组数据与流行病学数据的分析， 追溯到了疫情发生的原因、阐明了传播途径，最终实施了早期的感染控制，控制了院内传播。沙特阿拉伯 Saeb 等［40］通过NGS技术结合生物信息学、系统发育和病原学分析报道了首例人感染溶血梭菌 ( Clostridium haemolyticum) 。他们证实了NGS 在临床微生物病原体鉴定的应用，也证实了NGS技术对于更多微生物样本的分析在公共数据库中共享的重要性。 我国研究人员在2009年的这次新型H1N1流感爆发中，证实了二代测序平台用于未知病毒检测的重要作用，在事先没有知识或使用遗传信息的情况下在每个样本中产生数百万个有效读数并产生了几乎完整的核苷酸信息，确诊了流感暴发的病原为新型H1N1和季节性H3N2流感病毒[41]， 2012年荷兰研究人员利用二代测序技术454GS-FLX平台，在1例沙特急性肺炎转肾衰的死亡病例痰液中发现一种全新的中东呼吸综合征冠状病毒，［42］这些数据都表明了二代测序可以是诊断新发传染病的有用工具，对于不明病原体有着很好的鉴定与溯源作用。越来越多的研究证实WGS有可能从分离物中快速提供大量信息，包括物种，菌株类型，抗生素抗性，毒力以及其他爆发和病例管理信息。对病原体的溯源与监测方面表现出了较为明显的优越性。但目前对于个体患者的诊断和治疗方面，考虑到成本问题，其应用还不太广泛。而Köser等人[43]、Young等人[44]、Sherry等人[45]、Walker等人[46]的相关研究对于NGS技术在监测病原体爆发方面，也得出了与上述相似的结论。 重症下呼吸道感染病原体通常不明确，当前临床主要采用抗原/抗体免疫学方法、传统微生物培养等技术进行诊断，但这些方法多存在培养周期长、培养阳性率低的问题。二代测序技术是新型DNA／RNA测序方法，该技术基于对核酸分子的检测，敏感性高， 耗时短，不依赖于传统的病原学培养，前期抗生素应用对检测 影响小。在重症患者中，肺炎的发展导致显着的发病率和死亡率以及额外的医疗保健费用。准确，快速地鉴定肺部感染患者的微生物病原体可能会导致有针对性的抗菌治疗，可能产生的副作用更少，成本更低。Toma I等[47]利用NGS技术，在来自疑似肺炎的插管患者的支气管抽吸物进行测定，从与主要培养的病原体相同的属中鉴定出显着多样的细菌物种，很好的诠释了NGS可识别的细菌属的数量始终高于通过标准微生物方法鉴定的数量。Thorburn F等[48]在一项研究中利用89个呼吸道样本，将内部NGS方法与已建立的内部RT-PCR测试进行了比较。结果显示与RT-PCR相比，NGS的敏感性和特异性均低于RT-PCR测试，但NGS为检测到的病毒提供了更详细的类型信息，包括相关病毒的亚型数据以及血清型数据。还有一些研究指出[49.50]，NGS不仅能够产生实时诊断数据，还可以提供抗性测试和分型数据，这也可用于快速检测新型亚型的出现或突出潜在的爆发。其中Petty T.J. [49]设计的生物信息学管道（ezVIR）可用于用于处理来自任何标准平台的HTS数据，并同时评估已知人类病毒的整个范围，提供易于解释和定制的结果，该管道旨在使用包含11,000多个完整病毒基因组的全面手动策划数据库来识别病毒，而且，它自动为HTS中的非专业人员生成清晰简明（可自定义）的结果表示。随着二代测序技术的发展，将进一步减少处理和测序时间，NGS的测序方法最终将能够为临床医生提供快速，精确，独立于培养的细菌，真菌和病毒病原体鉴定及其抗菌敏感性特征。 白色念珠菌作为一种机会性真菌病原体，在机体免疫低下时时常会引发感染，除了可导致浅表感染外，它也可以在肺深部感染，肠道或甚至血液。Ｗｕ 等［51］从复旦大学附属华山医院 40位白假丝酵母菌感染的患者中分离出62株白假丝酵母 菌，通过MLST技术分析，结合住院史，指出该医院患者感染白假丝酵母菌可能是由于白假丝酵母菌的院内传 播，他们证实了MLST是研究白色念珠菌流行病学和进化的有用工具。新型隐球菌病是一种常见伺机性霉菌感染症，对于免疫低下人群常可致病，而新生隐球菌几乎全部经肺入侵而感染人体，90%病损仅局限于肺部，而还有10%可经血行传播扩散至其他器官。 Firacative等[52]对122株加特隐球菌Ⅲ型进行ＭＬＳＴ分型，并对其中的６０株进行全基因组ＳＮＰ分析，将该病原菌 划分成Ｂ和Ｃ两种主要的血清型，二者不仅群体的起源地不同，且发现主要是毒性更强的血清型B分离株可致肺隐球菌病，Ｃ型加特隐球菌对唑类抗生素的敏感性要低于Ｂ型加特隐球菌。也证实了菌株分型对于指导有效治疗以改善疾病结果的重要性。2011年，在一起耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌感染流行事件中，Snitkin等[53] 对患者身上分离到 的肺炎克雷伯菌进行进行全基因组测序，综合基因组学和流行病学分析将爆发追踪至单个患者的三次独立传播，最后发现这些菌株是医院常见的 ST258 型耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，并确定了主要传播者，推断出了可能的传播途径，而且他们的研究表明，基因组和流行病学数据的整合可以产生可操作的见解，有助于控制医院内传播。 多项分子分型技术联合使用可以增强对菌株的分辨力，提高分析的准确性。2012年我国有研究者将脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）联合，对我国南部7个地区19家医院感染鲍曼不动杆菌的患者的样本进行病原体监测，鉴定出146种多重耐药菌株（对超过7种药物具有抗性），利用PFGE将其划分为了15簇， 发现不同型别菌株的分布具有地区倾向性，又用MLST技术对主要细菌主要簇群进行分析，并分出11个ST型，其中ST208是普遍的，而CC92 簇的ST型鲍曼不动杆菌有更广的 耐药谱，研究结果还表明，华南地区的多重耐药鲍曼不动杆菌与其他国家的其他广泛菌株有着共同的起源[54]。在加拿大不列颠哥伦比亚省的一个中型社区，3年期间爆发了结核病。Gardy JL 等[55]使用全基因组测序和社会网络分析对32个结核分枝杆菌爆发分离株和4个历史分离株的完整基因组进行了测序。结果显示结核分枝杆菌的两个遗传上不同的谱系具有相同的MIRU-VNTR基因型，表明两个伴随的爆发，并发现社会环境因素 - 最有可能可卡因的使用增加 - 引发了两个现存的M系谱的同时扩张。由高风险社交网络的主要成员维持的结核病。仅基因分型和接触者追踪并未捕捉到爆发的真实动态。 2.3 NGS对肺部病原体耐药及毒力特征检测中的应用 对于肺部的感染性疾病，尤其是对于下呼吸道特殊病原体、未知病原体的感染，快速的了解病原体毒力概况对于预测疾病严重程度和转归，以及在疾病早期进行风险评估至关重要，快速的了解病原体的耐药性对于指导抗菌药物应用，提升治疗效果更是具有重要价值。以血清学培养为主要代表的传统检测技术，均有其相关的局限性[ 56.57]，例如血清培养学一方面需取决于微生物生长时长，通常需要长达5天，另一方面培养结果常常由于经验性抗生素治疗而产生假阴性结果。二代测序技术作为新型的DNA／RNA测序方法，随着这项技术的不断发展与研究，其不仅能够同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等各类病原体， 特异性高，同时还可以检出毒力基因、耐药基因的信息，且与传统测序技术相比，前期使用抗生素对检测结果的影响较小。 病原体耐药检测：耐药性微生物病原体的不断出现是一个具有全球重要性的问题。虽然正在开发新药，但是它们的广泛使用很快就会选择进一步的抗药性，对于肺部感染病人，我们常常会遇到由于不充分或长期使用广谱抗生素而产生耐药性的患者，这时候则需要对于抗生素相关毒性和多药抗性病原体的鉴定，最新有指南建议在诊断脓毒症后尽早（最好在1小时内）开始经验性抗生素治疗[58]，那么在这一阶段，对于致病病原体的鉴定及抗生素抗性和毒力基因的分析对于早期优化抗微生物治疗方案是至关重要的。Grumaz 等[59]的研究验证了二代测序检测耐药基因的可行性，而在最新NGS技术（即Oxford Nanopore的MinION装置）表明，已可以在更短的时间内对更大量的DNA进行测序，且已被证实使用该技术鉴定临床相关菌株和相应的抗性谱可在约2小时内完成，抗性基因的鉴定也可在2至12小时内可以控制，这大大缩短诊疗时间[60]。 在肺部感染的众多病原体中，病毒感染占据了重要位置，由于病毒结构简单的特点，易发生突变， 其基因组一旦发生任何变化均会影响后代的特性表 现。在抗病毒药物治疗时，病毒基因的异质性使其 在药物治疗过程中常出现耐药相关基因的突变，从而影响抗病毒治疗效果。VERWEIJ P E等的研究发现使用广谱抗生素影响真菌与细菌之间微生态平衡，导 致呼吸道真菌感染的发生以及病原体对抗真菌药产生耐药［61］。微生物监测已被认为是抗药性控制的基本组成部分，因为监测信息可以评估抗药性负担，确定风险因素，并确定抗性表型和基因型的趋势。随着NGS技术的发展，有多项试验都证实了NGS能检出 0.１％ ～１％水平的病毒耐药突变，且应用NGS技术可进行耐药病毒株的传播、低丰度耐药突变与临床用药关系、抗病毒药物 潜在作用靶点的探索、抗病毒治疗后患者耐药位点 突变的检测和探寻新耐药突变位点等方面的研 究［62.63.64］ 。如巨细胞病毒（CMV）的抗病毒治疗可能因与磷酸转移酶UL97和DNA聚合酶UL54突变相关的耐药性而变得复杂。Sahoo M K 等[65]利用二代测序技术开发了一种基于扩增子的高通量测序策略，用于检测临床血浆样本中的CMV药物抗性突变，该测定提供了对较小变体的更灵敏的检测和更高的多重能力。 耐多药的医院病原体是医院的主要负担。快速聚类鉴定和病原体分析，即抗生素抗性和毒力基因，对于有效的感染控制至关重要。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）现在是医院感染的主要原因之一。Leopold 等[66]利用WGS与等位基因分析相结合的方法，筛选出了1681个基因建立 cgMLST分型方法，对德国明斯特大学医院两间ICU病房的t001型 MRSA 进行了监测，WGS结果产生了高分辨力的等位基因谱，通过分析该等位基因谱将18株MRSA菌株分为两簇，并使用标准化的基因组提取基于等位基因的分型以及抗生素抗性和毒素基因谱，抗生素抗性谱与原始临床实验室易感性谱一致，而毒素谱还提供了一些以前未知的信息。Holden MT等[67]使用比较基因组分析确定了99.8％的MRSA分离株抗菌素耐药性表型的分子遗传基础，突出了病原体基因组测序作为诊断工具的潜力，证明当前大流行的EMRSA-15群体来自于20世纪80年代在整个英格兰传播的与卫生保健相关的MRSA流行病，证实了全基因组测序不仅可以为分子流行病学提供高度辨别力，而且可以为抗生素抗性提供预测。 另外，由于结核分枝杆菌生长速度极慢，通过传统培养和表型方法进行耐药谱检测至少要花费几个星期，所以结核分枝杆菌耐药性的研究一直是该领域的热点[68]。多重耐药结核病（MDR-TB）的出现和传播一直是控制结核病的严重威胁，且这种情况因更严重的广泛耐药性结核病（XDR-TB）的出现而得到加强。MDR-TB菌株已对所有氟喹诺酮类药物（FQ;特别是氧氟沙星，左氧氟沙星，莫西沙星和加替沙星）和所有二线注射药物（阿米卡星，卷曲霉素和卡那霉素）产生耐药性。在2014年，世界卫生组织（WHO）建议将认可的快速分子技术（Xpert MTB / RIF，线性探针检测）纳入监测系统和调查，以便在国家层面测试更多结核病（TB）患者的耐药性。Cabibbe A M等[69]认为全基因组测序（WGS）方法正在成为流行病学和耐药性常规监测的更强大工具，有望快速同时筛查所有临床相关突变，以确定对第一，第二线的抗性和新的抗结核药物。WGS技术对病原体的高跟踪力、高辨别力使得其战胜传统分子工具，以标准化方式提供深入和广泛的信息。经典测序和NGS方法已成功应用于最近在结核病和耐多药结核病（MDR-TB）负担高的五个国家进行的研究。使用DNA测序鉴定pncA基因及其启动子区域（pncA区域）中的突变以确定对PZA的基因型抗性，旨在通过pncA测序研究结核病患者对吡嗪酰胺的耐药水平[70]。这项工作创新地证明了在国家（外围和参考实验室）和超国家实验室之间建立了强有力的联系，前者可能处理间接或直接样本并生成测序数据，后者支持它们进行生物信息学分析和数据解释， 2013年的一项回顾性研究，研究者在分枝杆菌生长指示试管（ＭＧＩＴ）培养患者痰液，3天后直接从培养物中提取DNA，并使用Illumina Miseq 测序仪进行测序。结果鉴定出患者混合感染了２种不同的结核多药耐药菌株，并通过耐药基因的变异情况预测了其耐药谱，这项研究揭示了快速全基因组测序的潜力，且大大减少了诊断XDR结核病的时间[71]。Farhat MR等[72]使用116个新测序的和7个先前测序的结核分枝杆菌全基因组，我们鉴定了对47 种耐药菌株特异性的阳性 选择的全基因组特征，恢复了100％的已知抗性标记，对一种基因ponA1突变的功能性遗传分析证明了在药物利福平存在下的体外生长优势。 病原体毒力检测： 微生物毒力是一种复杂的、多因素的表型，与病原体的进化轨迹错综复杂地联系在一起，是许多细菌病原体的主要毒力因子，影响任何感染严重性的关键因素就是感染生物的毒力潜力，许多病原菌中的毒力岛一般指染色体上一段编码细菌毒力 的DNA片段，两侧常有重复序列和插入元件，其DNA片段 的G+C 百分比、密码使用与宿主菌染色体具有明显差异。目前有相关研究表明，二代测序技术可以直接从其基因组序列确定毒力表型从而预测毒力，如Laabei M等利用全基因组关联研究（GWAS）和机器学习方法确定了从90株MRSA分离株的基因组序列中预测毒力的可行性，证实了使用全基因组序列数据分析大量菌株以鉴定与特定性状相关的遗传特征可用于从基因型推断复杂表型[73]。 21世纪以来，随着抗生素在临床上越来越广泛的应用，感染性疾病的诊治也变得越来越困难，而呼吸系统是我们的“门户”，所以在肺部感染的表现则更为突出，主要表现为疑难病原体感染率增加，重症感染发生率高，细菌毒力增加，耐药率也明显增加，逐渐出现多重耐药甚至广泛耐药的病原体，这不仅大大加大了医生对感染性疾病的诊治难度，而且大大延长了患者患病时间，增加了感染死亡率。而对于肺部感染更是如此。 二代测序技术的不断发展，使得同时测定几百万甚至上亿条DNA或RNA序列的愿望成为了现实，并在基因组学、转录组学、宏基因组学研究等方面也取得了大量研究成果，并逐步深入到微生物学研究领域中。且经过二十余年的发展，目前NGS测序主要障碍成本问题已经逐步在得到解决，NGS的成本较前已经明显降低［74.75.76］。而NGS技术的飞速发展，对于肺部不明、疑难病原体，我们可以不依赖于培养结果，直接从样本中获得病原体的核酸序列信息；对于新爆发的或以呼吸道传播为主的流行性疾病，我们可以对其进行病原体的溯源与监测；对于肺部泛耐结核、MASA等耐药病原体，我们可以使用全基因组序列数据分析大量菌株以鉴定其病原体毒力并预测了其耐药谱，与Sanger 测序相比, NGS 不需要靶特异性引 物, 其优势在于单次运行即可用于所有病原体的鉴定和分型。NGS技术可在短时间内提供无与伦比的高分辨率基因分型，因此, 该技术可在医学微生物实验室和流行病学领域中发挥巨大作用。 参考文献：略 |
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