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NGS 技术在临床上的应用逐步趋于成熟，从早期的肿瘤基因检测，到如今大热的微生物病原核酸检测，NGS 技术以其快速、准确和高分辨率的特点，发挥着无可替代的作用。 微生物在地球上无处不在，从陆地到海洋，从衣物到皮肤，甚至我们的身体内部。 繁衍、变异、自然选择和生存斗争，是所有生物必须经历的。 因为生命的第一要义，是生存。 为了生存，必须斗争，生物之间为了争夺资源，以及生物与自然环境之间，都存在着斗争 ，在这个过程中，有些微生物能够与人类和平共处，甚至互利共生，而有的微生物则会使人患病，通常有细菌、真菌、病毒、支原体，以及衣原体，这些就是临床上的病原微生物。 冠状病毒示意图 自然选择需要经历漫长的过程，但是近年来环境污染，药物滥用，加快了病原微生物的进化速度，耐药菌，超级菌的出现，严重威胁着人类健康。 还有一些微生物，本来与人类没有交集，原先只存在于自然界，而有人为了猎奇，食用野生动物，从而把这些动物身上携带的病毒带到了人类社会，如本世纪初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，这类新型病毒对公共卫生健康形成了巨大的挑战，个别人的贪婪，给全世界的人们带来了巨大的灾难。 当健康受到了威胁，对付细菌，人类发明了抗生素， 对付病毒，发明了抗病毒药物，但要如何治疗，第一步是找出元凶，而这在临床上往往存在困难。 传统的血常规，或者器官和组织的影像学指标能够判断感染的可能性，但并不能作为确诊的依据，比如血常规只能告诉你是否有细菌或病毒感染，但不能告诉你是什么细菌或病毒，还需要进一步检查才能确诊，以便对症下药。 实验室检查，如抗原检测、核酸检测、代谢产物检测以及毒素检测才是明确感染、指导治疗和判断预后的重要手段。 细菌和真菌检测。通常需要先进行分离培养，再结合生化反应进行鉴定，并进一步进行药物敏感性试验，这种模式是临床微生物实验室惯用的经典模式，为临床解决了很多关键问题，然而其周期长、阳性率低、通量低等弊端往往难以满足临床日益增长的需求。 病毒、支原体、衣原体检测。难以像细菌一样进行分离培养，通常采用分子生物学方法如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）测定核酸，灵敏快速，但只限于已知病原体的检测，且检测结果提供的信息相对有限，难以解决由变异带来的医学问题。 为了克服传统方法的不足，下一代测序技术（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物检测中的应用具有非常大的优势，如： 通量大，一次可检测成百上千个物种，特别是未知的病原，测定其核酸序列是必不可少的手段； 直接测定病原微生物的核酸序列，能为临床提供准确的诊断依据，如物种鉴定、分型以及耐药突变等； 更低的检测限，即使病原微生物的丰度很低，也能够检测到。 当然，NGS 的缺点也是有的： 相对于 PCR，时效性处于劣势； 成本较高，暂时不会完全取代现行的常规鉴定手段。 即便有不足，但 NGS 的技术优势更为明显，在疑难微生物，以及难以培养甚至无法分离培养的少见菌属的鉴定，特别是新型病原微生物的暴发流行监测方面，NGS 快速、准确和高分辨率的特点，使其成为病毒鉴定的金标准，在流行病学分型中发挥着重要作用。 新型冠状病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正肆虐全球，目前尚无疫苗和特效药，人们除了戴口罩，注意个人卫生以及增加社交距离外别无他法，面对汹涌的疫情，再一次提醒人类，要放下自己是万物之灵的傲慢，因为微生物才是当之无愧的地球之王，它们在这个星球上生存的历史比人类更长，种类和数量也比人类要多得多。 佩戴口罩防病毒感染 我们不能，也不应该试图消灭所有微生物。我们之间的关系，不只有对抗，还有合作，但是当我们的健康受到威胁时，也要勇于斗争。 物竞天择，适者生存，人类与微生物的合作与斗争，必将永远进行下去。 临床微生物高通量检测，应用场景不同，各种测序技术令人眼花缭乱，但我们可以做如下总结。 检测对象：病原体核酸，或人宿主自身核酸 测序技术：DNA 测序，或 RNA 测序 测序范围：DNA 靶向，或 DNA 非靶向；所有 RNA，或部分 RNA 进而可以归纳为两大类，四小类测序策略。 以微生物核酸为检测对象： 病原基因组测序（metagenomic） 病原转录组测序（metatranscriptomic） 以人宿主自身核酸为检测对象： 人基因组测序（DNA-Seq） 人转录组测序（RNA-Seq） 目前，”病原微生物基因检测“约等于”病原宏基因组检测“，正如“精准医疗”约等于“肿瘤基因检测”一样。 作为宏基因组的补充，基于多重 PCR 的靶向测序，具有非常大的应用情景。 而其他技术，如宏转录组、RNA-Seq 研究病原与人的互作等目前都还处于探索阶段。 1. 非靶向测序（untargeted NGS，mNGS） 非靶向的宏基因组测序，优势是大而全，不管有多少种微生物感染，理论上都一次给测出来。不仅能测已知病原，还能发现未知病原体。 但是它最大的缺点，就是灵敏度严重依赖于受背景干扰的程度。特别是组织样本，含有大量人体细胞，测出来的数据 99% 都是人的 DNA 序列。 因此可以说，宏基因组测序，就是大海捞针。而靶向测序，则可与之互为补充。 2. 靶向测序（targeted NGS, tNGS） 靶向扩增子测序是先富集目的 DNA 序列，再测序。这样可以增加测序数据中目标序列的比例，进而提高检测的灵敏度。 常用于富含 DNA 的手段有扩增和捕获两种。 扩增： 通过 PCR 反应增加目的片段的数量。 捕获： 通过核酸探针与目的片段进行杂交，从而抓取目的序列进行测序。 显然，靶向测序只能用于核酸序列已知的病原体的检测。其好处是灵敏度高、成本低。 参考文献： Chiu C Y , Miller S A . Clinical metagenomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2019. |
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