【综述】二代测序技术在儿童下呼吸道感染病原检测中的应用

作者：陈梦雪　张建华
通信作者：张建华，Email：[e-mail]
作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院儿科 200092
本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2021,36(14):1115-1118.
引用本文：陈梦雪,张建华.二代测序技术在儿童下呼吸道感染病原检测中的应用[J].中华实用儿科临床杂志,2021,36(14):1115-1118.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20191106-01099.

摘要

二代测序（NGS）技术又称为高通量测序技术，与已经成为临床DNA测序标准方法的桑格测序相比，NGS技术更高效，可在较短的时间内以较低的成本获得大量信息。NGS技术在诊断及提高儿童下呼吸道感染病原检测、鉴别院内交叉感染病原、药物耐药性研究及疫苗开发等方面具有广阔的前景。在如何提高NGS技术诊断的特异性与敏感性，如何进一步优化二代测序技术等方面值得深入研究。

关键词

二代测序；下呼吸道感染；病原检测；儿童

急性呼吸道感染是儿童常见的感染性疾病，快速准确地确定病原体，进而进行早期针对性治疗对预后至关重要。近年来，随着生物技术的发展，各种新型的呼吸道病原体检测技术为疾病治疗、流行病学调查及疫情控制提供了有力支持^［1］。二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术又称高通量测序技术，是不依赖于传统微生物培养方法而明确样本中所有微生物分类及功能的检测技术，与已经成为临床DNA测序标准方法的桑格测序相比，NGS技术更高效，可在较短的时间内以较低的成本获得大量信息^［2］。现就NGS的平台与技术特征及其在儿童下呼吸道感染中的应用与检测价值及存在的局限性作一综述。

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NGS主流平台与技术特征

目前NGS领域中主要技术种类有Roche公司（瑞士）的454、Illumina公司（美国）的Solexa、ABI公司（美国）的SOLID三种典型测序技术和Ion Torrent、Heliscope、Nanopore、SMRT、Ion PGM、GeXp等测序技术。其中，454测序技术可读取长度约为700 bp，测序时间18~24 h，所采取的方法为焦磷酸测序，精确度为99.9%，数据产出量为 0.5 G，每百万碱基所需费用为10美元，其特点为高读长、速度快；Solexa测序技术可读取长度约为300 bp，测序时间为8~11 d，所采取的方法为可逆转末端合成测序，精确度为99.9%，数据产出量为4~1 800 G，每百万碱基所需费用为0.05~0.15美元，其特点为高通量、平台多；SOLID测序技术可读取长度约为75 bp，测序时间为2~7 d，所采取的方法为连接测序，精确度为99.9%，数据产出量为7~50 G，每百万碱基所需费用为0.13美元，其特点为成本低^［3］。
2009年，Ng等^［4］采用NGS技术对人类基因组外显子进行捕获测序，对单基因遗传病研究分析，全外显子测序（whole exome sequencing，WES）自此逐步成为遗传检测的主要技术平台。同年Illumina公司（美国）推出首款用于临床的全基因测序仪。2014年有研究者采用NGS技术对全基因组进行测序，即全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），提高了智力障碍患者的遗传病检出率^［5］，WGS成为重要的临床遗传检测技术^［6-7］。近年来，NGS技术在诊断儿童下呼吸道感染病原、鉴别院内交叉感染病原、药物耐药性研究以及疫苗开发等方面也显示出广阔前景。

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NGS在儿童下呼吸道感染中的应用价值

2.1　查找下呼吸道感染病原体　在感染性疾病中，下呼吸道感染在全世界范围内具有较高的死亡率^［8］。尽早准确地确定其病原学诊断，对实施针对病原体的治疗至关重要。但由于现有微生物学检测方法的局限性（培养敏感性较低，所需时间较长；血清学和聚合酶链反应检测到的微生物数量有限），其诊断仍具有挑战性。另外肺部不是无菌环境，在健康和疾病状态下均有微生物群落存在^［9］。如何将病原体与定殖菌群区分开来，是下呼吸道感染病原诊断面临的主要挑战。在危重患者中，类似于下呼吸道感染的非感染性炎症综合征使病原诊断更加复杂。有研究者对92例急性呼吸衰竭患者的气管吸入物进行NGS，同时评估病原体、呼吸道正常微生物组和宿主转录组，通过20例下呼吸道感染或非传染性急性呼吸道疾病患者建立了一个基于规则的模型(RBM)和一个基于逻辑回归的模型(LRM)，在24例患者的独立验证队列中进行测试时，2种模型的准确率均达到了95.5%，同时，通过病原体、微生物组多样性和宿主基因表达指标，以识别下呼吸道感染病原阳性患者和感染性急性呼吸道疾病的危重患者，结果显示，病原体度量执行接受者操作曲线下面积(AUC)为0.96(95%CI：0.86~1.00)，多样性度量AUC为0.80(95%CI：0.63~0.98)，宿主转录AUC为0.88(95%CI：0.75~1.00)，阴性预测值为100%^［10］。病原体、微生物组和宿主转录组的完整基因组描述的单一流线型方案可能有望成为诊断下呼吸道感染病原的有效工具。
2.2　提高下呼吸道感染病原诊断正确性　目前，临床上常规使用的下呼吸道感染病原诊断方法为通过支气管镜检查获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），通过培养研究下呼吸道感染病原微生物特征，但此方法有其自身局限性。研究表明，在相同实验条件下获取27份BALF样本，分别采用培养联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和NGS方法分析样本中菌落数，有些细菌仅能通过培养检测出来（如某些葡萄球菌属、梭菌属等），而有些细菌仅能通过NGS检测出来（如脆弱类杆菌、纤毛菌等）^［11］。究其原因，人体内的微生物有些是不可培养的，或因厌氧培养失败而导致最终结果假阴性。而NGS也有其自身局限性，如检测灵敏度取决于测序深度与长度，这可能导致某些低丰度细菌物种无法检测出；对于某些种内变异，NGS也无法检测到。因此，细菌培养与NGS检测相结合，一定程度上可提高病原诊断的正确性^［7］。
2.3　鉴别院内感染存在与否　NGS技术不仅可为一些难以确定病因的感染性疾病查找病原体，还可用于院内感染的推断调查。西雅图儿童医院选取了4例鼻病毒（HRV）检测阳性，且于入院3 d 后出现临床症状的住院患儿进行NGS检测，结果发现了3个HRV-C序列和1个HRV-A序列，再对3个HRV-C序列进行两两比较，发现其分别具有15 752 277和2 192个核苷酸差异，继续对2个最接近的HRV-C菌株进行研究，发现其最近祖先出现在172年前，并不存在传播关系，由此排除了同一源性院内感染传播^［12］。不同的呼吸道病原具有不同的院内传播潜力，预防呼吸道病原院内交叉感染的主要措施是接触预防和抗感染治疗，借助NGS技术可对病原的感染和流行进行“溯源”研究，有助于院内感染的预防与治疗^［13］。
2.4　药物耐药性研究与疫苗开发　随着药物使用年限的不断增长，临床上耐药现象越来越普遍。因此，迅速准确地检测药物敏感性越来越重要。目前，主要依据药敏试验来选择敏感抗生素，但培养微生物的过程缓慢，常常不利于患者的早期治疗。尤其对于结核分枝杆菌这类生长速度极缓慢的微生物来说，药敏试验时间过于漫长^［14］。目前，耐药结核的发病率越来越高，选择个体化药物和治疗方案也越来越重要。有研究对24例痰涂片阳性的标本分别进行培养和基因检测，结果表明，表型抗性和基于基因型的预测抗性之间具有高度一致性，且基因检测明显快于微生物培养^［15］。因此，NGS技术有助于更好地了解耐药结核的进化、致病性和发病机制，在预测药物敏感性和耐药性及疫情调查等方面可大有作为^［16］。另外，使用NGS技术对其发病机制和功能性基因的研究，并通过特定方法（如信号标签诱变和转座子原位杂交）抑制功能性基因表达有利于减毒疫苗的开发^［17］。

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NGS在儿童下呼吸道感染病原检测中的应用

3.1　快速的细菌检测　采用NGS技术进行病原检测可较传统培养技术更快地识别病原体。1例原发病灶在腹部的脓毒症患者出现了肺部感染，行支气管镜技术取BALF后，同时进行细菌培养和NGS检测，揭示了6个高质量的DNA序列读数（909~8 288 bp），每个碱基对都与金黄色葡萄球菌的基因组良好对齐，次日微生物实验室报告了同一样本中有金黄色葡萄球菌生长^［18］。可见NGS技术可优化医院对此类疾病的诊断和管理。
3.2　病毒检测　众所周知H3N2流感病毒具有较高的发病率和死亡率，但季节不同其严重程度也不尽相同。为了解其中差异产生的机制，有研究采用NGS技术对176例H3N2流感基因组进行测序，发现了与严重程度相关的氨基酸片段NA V263I和NS1 K196E，且宿主中此类片段含量越高，病情越严重^［19］。因此，NGS可作为探索严重流感基因组特征的有效工具。
有研究对8例明确下呼吸道感染的患儿和2名健康成人分别进行聚合酶链反应和WGS。结果显示，聚合酶链反应组检测出2例HRV感染，1例为人偏肺病毒感染，1例为呼吸道合胞病毒感染，4例阴性，2名健康成人均为阴性。WGS检测出3例HRV感染，1例为人偏肺病毒感染，1例为呼吸道合胞病毒感染，3例阴性，2名健康成人均为阴性，可见WGS的灵敏度不低于聚合酶链反应，进一步研究表明，由于HRV靶区域存在异质性，使用常规分子诊断方法可能会漏掉HRV阳性样品^［20］。因此，WGS能提高呼吸道病毒感染的病原学诊断阳性率。
3.3　不典型病原微生物检测　肺炎支原体肺炎占住院儿童社区获得性肺炎（CAP）的10%~20%^［21］。目前，核酸和血清学检测（特异性试验和非特异性试验）是诊断肺炎支原体感染的常用且有效方法。近年来随着NGS技术的不断优化，其在肺炎支原体肺炎的流行病学、诊断及治疗等方面显示了优越性。首先，WGS对支原体基因表型的分析与对比有助于加深对其生物学和流行病学特点的认识。通过对BALF进行NGS检测，有助于临床证实是否存在肺炎支原体感染^［22］。其次，NGS对难治性支原体感染的经验性治疗提供了方向与理论支持^［23-24］。难治性支原体感染患儿其C反应蛋白水平往往较高，但尚不清楚高水平的C反应蛋白是由过强的免疫反应引起，还是由感染引起，或免疫反应和感染共同导致^［23］。有研究回顾性分析了675例难治性肺炎支原体肺炎（refractory mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）患儿病例，采用NGS和培养的方法对其BALF中病原进行检测，仅18例发现了支原体感染，NGS与培养结果一致，这提示，高水平C反应蛋白可能主要由过强的免疫反应引起^［23］。这为糖皮质激素应用于RMPP患儿的治疗和疗效显著提供了依据^［19］。另外，有报道1例患CAP且通过常规方法未能检测出任何病原体的婴幼儿，通过NGS方法检测到了沙眼衣原体^［25］。
3.4　真菌检测　侵袭性肺曲霉病（IPA）是一种威胁生命的机会性真菌感染，主要发生在有免疫缺陷或血液系统恶性肿瘤的患者身上^［26-27］。早期诊断与治疗可大大降低死亡率^［28］。1例65岁且有50年支气管哮喘病史的男性患者因“反复发热、咳嗽、咳痰18 d”入院，胸部CT提示肺部散在结节，痰培养阴性，予抗生素治疗效果不明显，最后其BALF的NGS检测提示烟曲霉感染，予伏立康唑抗真菌治疗后，症状明显好转^［26］。

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NGS存在的问题与发展方向

自2005年NGS开展以来，其使用率大大增加，但其面临的挑战也不容小觑。首先，很多有关临床样本和质控实施情况仍无系统完备的评价流程。NGS包含大量步骤，为确保生成序列的质量，其每一步都必须严格把控，包括标本环境和试剂的污染也需严格把控^{［2，25，29-33］}。但目前已有更有效且易于使用的NGS流程不断问世^［34］。其次，虽然NGS改变了基因学的发展，且应用越来越广泛，但由于一些病毒核酸的丰度较低，也导致了NGS病毒检测的灵敏度降低^［35］。目前有研究者提出使用两组互补的探针来提高临床样本中的密集效率，即第1组探针针对整个基因组，主要鉴别已知病毒和全基因组序列；第2组探针针对靶向病毒或保守区域，主要检测样本中已知或未知病毒，此种探针更侧重于病毒家族，亚家族和基因序列中的保守区域，可富集更多样化的病毒组合，如近期发现的类SARS病毒MERS-CoV、骆驼冠状病毒HKU23和科罗拉多蜱热病毒^［35］。再者，目前疫苗的推广和有效性仍存在较多不确定性。以流感病毒为例，目前流感病毒对全民健康和社会经济来说仍是很大挑战，控制流感暴发最有效的方法仍然为疫苗接种^［36］。但由于部分疫苗与流感病毒之间的错配问题、耐药菌株的出现及基因突变等原因，致使当前疫苗的有效性仍不确定。而日益发展的NGS技术可使我们更深刻和便捷地认识病原体的基因组，了解其发病机制，研发出更经济、有效的疫苗^［19］。

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小结

毫无疑问，NGS技术在下呼吸道感染病原中的检测，尤其对于不明原因感染而急需明确病原的诊断与鉴别中具有广阔的前景。对于下呼吸道感染病原诊断正确性的提高、院内交叉感染的鉴别、药物耐药性研究及疫苗开发等方面具有重要意义。在如何提高其诊断的特异性与敏感性，如何进一步优化NGS技术等方面仍值得深入研究。

参考文献略

（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）

《中华实用儿科临床杂志》