37例CD45阳性的多发性骨髓瘤浆细胞免疫学表型特征

GXF360 2017-06-10

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37例CD45阳性的多发性骨髓瘤浆细胞免疫学表型特征

刘帅，李曌博，张帆，王宁宁，岳保红

（郑州大学第一附属医院检验科郑州大学医学检验系，河南郑州 450052）

摘要：目的通过分析CD45阳性（CD45+）多发性骨髓瘤（MM）浆细胞的免疫表型特征及其与CD45阴性（CD45-）MM浆细胞免疫表型的区别，探讨CD45表达与MM临床特征的相关性。方法回顾性分析192例初诊MM患者浆细胞的免疫表型，收集2个组的相关临床信息及实验室数据进行比对研究。结果根据浆细胞CD45的表达情况将192例MM患者分为CD45+MM组（37例，浆细胞的CD45平均表达荧光强度＞102）和CD45-MM组（155例）。CD45+MM组浆细胞CD138﹑CD38﹑CD19﹑CD56﹑CD20﹑CD71﹑CD117﹑CD33的阳性率分别为83.8%﹑97.3%﹑32.4%﹑64.9%﹑21.6%﹑51.4%﹑35.1%﹑24.3%；胞浆κ轻链和λ轻链的阳性率均为45.9%，有8.2%不表达轻链。2个组浆细胞CD19﹑CD71和 CD138的阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）；其他抗原的阳性率及胞浆轻链的表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论CD45+MM患者浆细胞CD19和CD71阳性率明显升高，而CD138阳性率明显降低，推测其分化阶段可能处于浆细胞的偏早期。

关键词：CD45；免疫表型；多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种中老年人常见的血液系统恶性肿瘤，以骨髓中浆细胞恶性增生并分泌单克隆免疫球蛋白和溶骨性破坏为特征，临床表现多样且不同，患者的生存期相差很大，从几个月到10多年不等。对于临床表现和骨髓形态学检查不典型的MM的诊断，流式细胞术（ fl ow cytometry，FCM）起到了重要的作用。典型MM患者的浆细胞CD45表达为阴性（CD45-）。但有少部分MM患者浆细胞表型为CD45阳性（CD45+）[1]，提示CD45表达发育紊乱，而这部分MM患者的免疫表型有什么特点，与典型MM（CD45-）患者免疫表型有哪些不同，国内还未见相关报道。为此，我们分析了CD45+MM患者浆细胞的免疫表型特征，以期减少MM的临床漏诊和误诊率。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取郑州大学第一附属医院2013年8月—2015年11月收治的初诊MM患者192例，其中男110例，女82例，年龄33～89岁。所有MM患者的诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》[2]的诊断标准。

1.2 病例入选﹑排除标准

所有患者均为初次收治入院，未进行过任何治疗。入院后进行骨髓细胞FCM检测﹑血和尿M蛋白﹑血清蛋白电泳以及肾功能等MM相关实验室检查[3]，并最终诊断为MM。排除标准：复查患者﹑微小残留病检查患者以及使用外周血进行FCM检测的患者。

1.3 FCM检测

鼠抗人单克隆抗体[CD38-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）﹑CD138-别藻蓝蛋白（allophcocyanin，APC）﹑CD19-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）﹑CD56-PE﹑CD20-APC﹑CD33-FITC﹑CD117-PE﹑CD45-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridininchlorophyll-protein complex，PerCP）﹑CD71-PE﹑κ轻链-FITC﹑λ轻链-PE]以及阴性对照（鼠IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-PerCP/IgG1-APC）﹑BD FCM红细胞裂解液﹑破膜剂（BD Instrasure A+B）均购自美国BD公司，以Beckman-Coulter血液分析仪系列稀释液（以下简称稀释液，美国贝克曼库尔特公司）作为FCM鞘液。仪器为BD FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4 细胞膜表面抗原检测

取患者新鲜乙二胺四乙酸二钾抗凝骨髓液，涂片，瑞氏染色后在光学显微镜下观察细胞形态并计数，调整细胞数至（4～10）×109/L，将骨髓液用适量稀释液洗涤3次，取100 μL洗涤过的骨髓液加入单克隆抗体原液（不同荧光标记抗体加样量不同，FITC为7 μL，PE为5 μL，PerCP为5 μL，APC为2 μL），室温避光孵育20 min，加入溶血素2 mL溶解红细胞（red blood cell，RBC），避光反应10 min，稀释液洗涤1遍后上机，获取50 000个骨髓细胞，分析其表面抗原的表达情况。

1.5 细胞胞浆抗原检测

将调整浓度后的100 μL骨髓液加入破膜剂，避光反应10 min，稀释液洗涤1遍后加入单克隆抗体（κ/λ轻链组合抗体5 μL，同时加入CD45和CD138），室温避光孵育30 min，加入溶血素2 mL溶解RBC，避光反应10 min，稀释液洗涤1遍后上机，获取50 000个骨髓细胞，分析κ/λ轻链的表达情况。

1.6 FCS express 4.0软件分析

采用CD45/SSC组合图形对骨髓所有细胞进行分群，以鼠IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-PerCP/IgG1-APC作为同型对照，用CD38+（阳性强度为+++）和CD138+圈定浆细胞群体[4-5]，根据CD19﹑CD56的表达情况初步圈定正常浆细胞和异常浆细胞[6]。采用FCS Express 4.0软件分析MM患者浆细胞各种抗原的表达情况。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。2个组之间的多种抗原表达情况比较采用χ2检验及Fisher确切概率法（当存在理论格子数＜5时，采用Fisher确切概率法）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 根据MM浆细胞免疫表型进行分组

通过FCS express 4.0 软件对192例MM患者的免疫表型进行分析，筛选出浆细胞集中在流式细胞图（SSC/CD45-PerCP）上CD45+区（CD45表达强度均＞102）的MM患者（CD45+MM组）37例，占19.3%，其浆细胞典型表型见图1；其他155例MM患者（CD45-MM组）浆细胞均集中在流式细胞图上CD45-区，其肿瘤细胞典型表型见图2。

图1 CD45+MM患者浆细胞的抗原表达

注：（a）CD38+/CD138+联合设门；（b）CD38+/CD138+浆细胞在SSC/CD45+区；（c）CD56/CD19用来圈定异常浆细胞（CD56+/ CD19+）；（d）浆细胞胞浆λ轻链呈单克隆性表达

图2 CD45-MM患者浆细胞的抗原表达

注：（a）CD38+/CD138+联合设门；（b)CD38+/CD138+浆细胞在SSC/CD45-区；（c）CD56/CD19用来圈定异常浆细胞（CD56+/ CD19-）；（d）浆细胞胞浆λ轻链呈单克隆性表达

2.2 CD45-MM组和CD45+MM组的性别及年龄分布

CD45+MM组男女发病率﹑年龄分布与CD45-MM组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 CD45-﹑CD45+MM患者的性别﹑年龄分布 [例（%）]

组别例数中位年龄＜60 60～70 ＞70 CD45+MM组 37 23（62.2） 14（37.8） 60.8 13（35.1） 19（51.4） 5（13.5）CD45-MM组 155 87（56.1） 68（43.9） 60.7 68（43.9） 58（37.4） 29（18.7）性别年龄（岁）男女

2.3 2个组MM患者浆细胞的抗原表达情况比较

与CD45-MM组比较，CD45+MM组浆细胞CD19和CD71的阳性率明显增高（P＜0.05），而CD138阳性率则明显降低（P＜0.05），其他抗原的阳性率及胞浆轻链的表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 CD45-﹑CD45+MM患者浆细胞各抗原阳性率的比较 [例（%）]

组别例数 CD138 CD38 CD19 CD56 CD20 CD71 CD117 CD33 轻链类型κ λ 阴性CD45+MM组 37 31（83.8）（8.2）CD45-MM组 155 154（99.4）36（97.3）12（32.4）24（64.9）8 9 3（21.6）19（51.4）13（35.1）（24.3）17（45.9）17（45.9）（5.85）统计值 0.610 0.020 1.772 24.955 0.250 0.011 2.415 P值 0.000 0.193 0.000 0.889 0.183 0.000 0.617 0.916 0.299 155（100）0 9（0.0）105（67.7）18（11.6）20（12.9）64（41.3）39（25.2）53（34.2）93（60.0）

3 讨论

近年来，随着人们对MM认识的加深，对一些非典型（临床表现和实验室指标不典型）MM患者的诊断较困难，因此FCM越来越多的被用到MM的检测及诊断中。多参数FCM能对单个细胞进行多个抗原检测，可以同时对细胞表面及细胞胞浆抗原进行检测，并且可以定量分析其表达水平，因此FCM可以很好的识别并呈现MM瘤细胞的各种表型特征。浆细胞是B淋巴细胞分化发育的终末阶段，在B细胞向浆细胞分化的过程中，许多B细胞的免疫标志逐渐丢失，正常浆细胞免疫表型特点为CD19+/CD38+/CD138+/ CD45-，胞浆轻链无克隆性或限制性表达。在B淋巴细胞向浆细胞的分化过程中，CD45和CD19的表达荧光强度较正常成熟B淋巴细胞有所减弱，不表达CD56﹑CD117﹑CD33﹑CD23和CD20。典型的MM浆细胞免疫表型特点为异常表达CD56，交叉表达CD33和/或CD117，CD19表达丢失，胞浆轻链呈单克隆或限制性表达[7]。但临床工作中我们发现有少部分MM患者的浆细胞为CD45+。

回顾性分析192例初诊MM患者的免疫表型，结果显示CD45+MM占19.3%。与典型MM免疫表型不同，CD45+MM患者浆细胞CD19和CD71的阳性率明显增高，CD138阳性率明显降低，而其他抗原（CD38﹑CD56﹑CD20﹑CD33和CD117）的阳性率及胞浆轻链的表达差异均无统计学意义（P＜0.05）。由此提示，MM瘤细胞的克隆可能经历了一定程度的分化和成熟，免疫标志物，特别是CD19和CD45在早期或浆母细胞中可能会出现阳性表达[8]。有研究表明抗原分子表达不同的各MM瘤细胞，其增殖能力和分化潜能也不同，从而临床生物学特征也各不相同[9]。因此，研究能够反映MM瘤细胞生物学行为的免疫标志，有助于临床医生调整治疗策略和判断疾病病程及预后[10]。

CD45是单链跨膜糖蛋白，广泛存在于造血系细胞表面，是白细胞（white blood cell，WBC）共同抗原。在CD45对MM患者的临床生物学特征影响方面，近年来有学者作了一些探索。有研究指出，以MM浆细胞CD45的表达情况进行分群，最能体现MM各个亚群之间的生物学行为的区别[11]。MOREAU等[12]的研究结果显示，在MM患者中，CD45+患者需要接受的治疗剂量比CD45-患者低，同时表明CD45抗原表达是MM的一个独立预后指标，浆细胞不表达CD45的MM患者的生存期比CD45+MM患者明显缩短，CD45-的MM患者累积总生存期为4年，平均为42个月。刘莉等[13]对116例MM患者的免疫表型特征进行分析，发现CD45+患者分期较好，CD45与贫血﹑肾损害关系不大，其表达缺失者易出现骨质破坏，微球蛋白﹑C反应蛋白水平较高。JOSHUA等[14]研究发现，与CD45-相比，CD45+浆细胞具有更高的增殖率，CD45+浆细胞在MM中的发病机制和疾病进展中可能发挥重要作用。KUMAR等[15]的研究结果显示CD45是抗原调制信号的关键调节器，可以激活淋巴细胞，在浆细胞早期阶段出现；与进展期MM（新发或复发MM）相比，浆细胞在早期MM（冒烟型MM）中表达CD45的比例明显增高。欧阳涓等[16]研究发现CD45的表达率与MM中原始浆细胞的比例呈负相关。由此可见，MM浆细胞CD45的表达与细胞处于分化偏早期阶段有关。

CD71即转铁蛋白受体1，可以反映血液肿瘤细胞的增殖活性，即增值活跃的肿瘤细胞表面CD71表达水平明显增高[17]。本研究结果显示CD45+MM组浆细胞CD71表达率明显高于CD45-MM组，这也再次证明了前者肿瘤细胞的高增殖性。有研究发现CD138在分化﹑发育处于早期阶段的浆细胞中为阴性[18]，而本研究的结果显示CD45+MM组浆细胞CD138阳性率明显降低，由此可以反向推测该类浆细胞正处于分化的偏早期阶段。

综上所述，浆细胞CD45的表达率与MM细胞的分化程度呈正相关[16]，分化越差﹑形态越幼稚的浆细胞的比例越高，CD45的表达率越低，这就意味着患者疾病进展越后期，其预后也越差。这也给了我们启示，在没有条件开展流式细胞免疫分型的情况下，可以通过细胞形态学检测MM细胞的成熟度以达到临床分期﹑指导治疗和判断预后的目的。

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Plasmocyte immuno-phenotype characteristics of 37 cases of CD45-positive multiple myeloma

LIU Shuai，LI Zhaobo，ZHANG Fan，WANG Ningning，YUE Baohong.
（Department of Clinical Laboratory，the First Af fi liated Hospital of Zhengzhou University/Faculty of Laboratory Medicine，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，Henan，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the plasmocyte immuno-phenotype characteristics of CD45-positive（CD45+） multiple myeloma（MM） and its difference with the plasmocyte immuno-phenotype characteristics of CD45-negative（CD45-）MM，and to analyze the correlation of CD45 expression with MM clinical characteristic.Methods The data of 192 MM patients were reviewed for immuno-phenotype analysis.ResultsAccording to CD45 expression，192 MM patients were classified into CD45+MM（CD45 average fluorescence intensity on plasma cells ＞102） group（37 cases） and CD45-MM group（155 cases）. In CD45+MM group，the positive rates of CD138，CD38，CD19，CD56，CD20，CD71，CD117 and CD33 were 83.8%，97.3%，32.4%，64.9%，21.6%，51.4%，35.1% and 24.3%. The positive rates of κ and λ light chains were 45.9%. There was 8.2% with no light chain expression. The positive rates of CD19，CD71 and CD138 had statistical signi fi cance between the 2 groups（P＜0.05）. There was no statistical signi fi cance between the 2 groups for the positive rates and light chain expression of CD38，CD56，CD20，CD117 and CD33（P＞0.05）.ConclusionsFor CD45+MM patients，their CD19 and CD71 positive rates increase，and CD138 positive rate decreases. CD45+MM cells may be in the early differentiation stage of plasma cells.