患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群分析曾艺鹏1， 胡 燕2， 吴 平2， 冯新格1， 谷成英1， 郭亚芳1 （1. 上海市浦东医院中医科，上海 201399；2. 上海市浦东医院检验科，上海 201399 ） 摘要：目的 探讨患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群的变化特征。方法 以21例患2型糖尿病的肥胖者作为研究组，21名血糖正常的肥胖志愿者作为对照组。取研究组和对照组新鲜粪便，采用Illumina Miseq高通量测序平台对粪便样本中所有细菌的16S rRNA-V3区进行DNA测序，分析肠道菌群物种的丰度和分布，并进行聚类分析。采用实时定量聚合酶链反应（PCR）对肠道菌群进行定量分析。结果 成功进行了DNA测序分析，样本稀疏曲线显示测序深度充分，测序覆盖深度（Coverage指数）＞0.99。研究组肠道菌群2个丰度指数（Ace和Chao1）均低于对照组（P＜0.05），2个多样性指数（Shannon和Simpson）分别低于和高于对照组（P＜0.05）。实时定量PCR结果显示，在门水平，研究组的厚壁菌门和放线菌门均低于对照组（P＜0.05），而拟杆菌门高于对照组（P＜0.05），其他2个菌门（变形杆菌门和梭形杆菌门）差异无统计学意义（P＞0.05）；在属水平，研究组的韦荣球菌属、Ⅳ型梭菌属和拟杆菌属均高于对照组（P＜0.05），而乳杆菌属、Blautia球菌-直肠真杆菌属、普雷沃菌属和双歧杆菌属均低于对照组（P＜0.05）。结论 患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群的丰度和多样性下降，定量分析肠道菌群的构成对该人群有特殊意义。 关键词：肠道菌群；2型糖尿病；肥胖； 高通量测序 2型糖尿病占糖尿病患者人数的90%以上，是一种受遗传和环境双重因素影响的综合性疾病，而环境被认为是导致其发病率增加的主要原因。2型糖尿病患者除有明显的家族史外，肥胖是诱发糖尿病的主要环境因素。然而，大部分肥胖者可以一直保持血糖在正常范围内。近年来，已有文献报道肠道菌群与肥胖存在关联［1-2］，同时有诸多文献报道胰岛素抵抗也是一种低级的炎症反应［3-4］，而胃肠道菌群兼具基因及环境双重因素。研究患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群情况，可以为该病的发病机制提供进一步佐证，并为治疗策略的制定和预后的评估提供参考。 材料和方法一、研究对象 收集上海市浦东医院门诊就诊的21例患2型糖尿病的肥胖者作为研究组，通过空腹糖耐量试验确诊。排除标准：年龄＜18岁，患肠道器质性疾病，有腹部手术史，处于怀孕期或哺乳期，近2周内使用过膨胀剂、止泻药、解痉药、益生菌及抗菌药物。同时收集21名血糖正常的肥胖者作为对照组，经临床体检证实身体健康，无胃肠道症状，近1个月内未服用任何抗菌药物。 二、方法 1.样本采集 无菌条件下获取研究对象自然排出的新鲜粪便，避开表面，采集中心部分粪便（10±5）g，放入无菌冻存管后立即速冻，采样程序符合医院伦理要求。粪便样本送至实验室，-80 ℃保存备用。 2.DNA提取 采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit（德国QIAGEN公司）提取100 mg粪便样本中微生物的总DNA，具体步骤按说明书操作。所提取的 DNA 用NanoDrop ND-1000分光光度计（美国Rockland公司）测定浓度后，于-80 ℃保存备用。 3.聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及产物测序 用所提取的总DNA作为模板，16S rRNA PCR引物由测序接头引物、Index和V3区引物3部分组成。Index为6 bp核苷酸随机组成的序列，以标记PCR产物的来源。PCR扩增体系共25 μL，其中2×Master Mix（NEB公司，美国）12.5 μL，引物各1.5 μL，模板2.5 μL，灭菌双蒸水7 μL（如模板 DNA 浓度较低则不加灭菌双蒸水，加等体积的模板）。扩增条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃ 10 s、 50 ℃30 s、 72 ℃ 30 s，20个循环；最后 72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反应结束后，将全部反应产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色）检测扩增片段大小，采用QIAquick Gel Extraction Kit（德国QIAGEN公司）对目的条带胶回收纯化。将纯化后的16S rRNA-V3区的PCR产物采用Illumina Miseq高通量测序平台（美国Illumina公司）进行测序。 4.生物信息学分析 PCR产物采用Illumina Miseq高通量测序平台进行高通量测序。随后对高质量序列进行提取。提取方法：将Miseq测序得到的“PEreads”首先根据“overlap”关系进行拼接，将成对的“reads”拼接成一条序列，同时对“reads”的质量和“merge”的效果进行质量控制和过滤，去除序列末端的后引物和接头序列、多碱基N、polyA/T尾巴及低质量碱基；去除所得序列的“barcode”标签序列、前引物序列；丢弃长度短于200 bp、模糊碱基数＞0、序列平均质量＜20的序列。高质量序列的生物信息学分析：（1）操作单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析。提取非重复序列，使用QIIME数据处理平台进行序列的生物信息学分析，与silva数据库中已比对的序列数据库的参考序列进行比对，将相似性在97%以上的序列进行归并，生成分类OUT。（2）菌群多样性分析。根据OTU聚类分析结果进行alpha和beta多样性计算，采用丰度指数（Ace、Chao1）和多样性指数（Simpson、Shannon）分别对样本进行分析。（3）稀疏曲线分析。采用 R软件在97%相似性水平绘制样本稀疏曲线，比较测序数量不同的样本物种的丰富度并评估样本的取样大小是否合理。（4）菌群分类学分析。采用R软件将OTU中全部序列与silva数据库中的参考序列进行比对，找出其最相近且可信度达80%以上的种属信息。并将每一个OTU中的所有序列进行类比，找出同一OTU中的不同序列最相近祖先的种属信息。根据silva数据库中的参考序列对OTU进行种属鉴定。（5）菌群群落结构分析。根据菌群分类学分析比对结果，对样本群落结构进行菌群种类和丰度分析。 5.实时荧光定量PCR 采用ABI实时定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）对肠道中最常见的细菌分别进行定量检测。PCR均采用25 μL反应体系，包括2×PCR Mix、2 U Taq DNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTP、正向和反向引物各0.1 μmol/L以及 5 μL DNA模板。反应程序：95 ℃1 min；95 ℃ 25 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，40个循环。荧光定量PCR均以浓度101～108拷贝/μL 的标准菌种16S rRNA基因片段的质粒DNA构建标准曲线，用每克粪便16S rRNA基因拷贝数的对数值表示2个组别所有个体细菌数量。样本定量数据经log10转换后录入SPSS 17.0统计软件并进行统计分析。PCR引物序列见表1。 三、 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。一般计数资料进行χ2检验，组间和组内相似性系数等计量资料结果以 表1 实时定量PCR的引物序列  菌种 引物序列 产物序列长度（bp）拟杆菌门 F: CATGTGGTTTAATTCGATGAT 126 R: AGCTGACGACAACCATGCAG厚壁菌门 F: ATGTGGTTTAATTCGAAGCA 126 R: AGCTGACGACAACCATGCAC放线菌门 F: CGCGGCCTATCAGCTTGTTG 600 R: CCGTACTCCCCAGGCGGGG变形杆菌门 F: CATGACGTTACCCGCAGAAGAAG 195 R: CTCTACGAGACTCAAGCTTGC梭形杆菌门 F: CCCTTCAGTGCCGCAGT 273 R: GTCGCAGGATGTCAAGAC拟杆菌属 F: GAGAGGAAGGTCCCCCAC 106 R: CGCTACTTGGCTGGTTCAG普雷沃菌属 F: GGTTCTGAGAGGAAGGTCCCC 121 R: TCCTGCACGCTACTTGGCTGⅣ型梭菌属 F: GCACAAGCAGTGGAGT 239 R: CTTCCTCCGTTTTGTCAA乳杆菌属 F: GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC 126 R: GGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTC韦荣球菌属 F: ACCAACCTGCCCTTCAGA 343 R: CGTCCCGATTAACAGAGCTT Blautia球菌-直肠真杆菌属 F: CGGTACCTGACTAAGAAGC 429 R: AGTTTCATTCTTGCGAACG双歧杆菌属 F: CTCCTGGAAACGGGTGG 550 R: GGTGTTCTTCCCGATATCTACA 结 果一、研究对象的一般情况 通过问卷调查发现，研究组和对照组间饮食习惯及户外锻炼情况差异无统计学意义（P＞0.05）。除空腹血糖、糖化血红蛋白及空腹胰岛素水平2个组间差异有统计学意义（P＜0.05）外，其他指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。 二、菌群群落结构分析 通过序列分析，在菌门水平上研究组和对照组样本主要包含5个菌门，其中厚壁菌门与拟杆菌门之和约占90%，变形杆菌门、放线菌门和梭形杆菌门各占1%～5%。拟杆菌门的序列主要是拟杆菌纲，厚壁菌门的序列主要是梭菌纲，其他还有产芽孢菌和芽孢杆菌，分别占所有序列的7%和2%。 样本稀疏曲线是统计研究对象所代表的物种数目，并以个体数和物种数来构建的曲线，其可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。本研究样本的稀疏曲线见图1，在序列数＜2 000条时，样本稀疏指数随序列数增加而迅速增加，在序列数＞6 000条时，样本稀疏指数增加缓慢之后则进入平台期。大部分样本的稀疏曲线趋于平缓，这表示样本中大部分的物种都被检测到。对照组样本稀疏指数范围为52～221，而研究组样本稀疏指数范围为47～162。 三、肠道菌群丰度及多样性分析 通过16S rRNA-V3区的深度测序，经97%相似性归并后研究组和对照组的测序覆盖深度（Coverage指数）＞0.99。对照组患者Reads指数（23 454.33±2 224.89）略高于研究组（22 921.45± 1 258.76），但差异无统计学意义（P=0.057 6）。2个组研究对象所获得的OTU差异有统计学意义（P=0.000 0）。Ace或Chao1越大说明菌群丰度越高，对照组的Ace和Chao1分别是（209.77±32.21）和（225.54±43.55），而研究组分别为（119.09±24.91）和（187.49±36.42），2个组差异有统计学意义（P＜0.05）。Shannon越大或Simpson越小表明群落多样性越强，对照组Shannon和Simpson分别为（3.23±0.89）和（0.088 7±0.050 1），研究组分别为（2.39±0.76）和（0.128 7±0.071 2），2个组差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组Shannon范围为2.71～4.09，而研究组Shannon范围为1.32～3.65。见表3、图2。 表2 研究对象的基本资料  注：BMI为体重指数（body mass index） 组别 年龄（岁）性别（男/女）BMI（kg/m2）空腹血糖（mmol/L）糖化血红蛋白（%）空腹胰岛素（mU/L）甘油三酯（mmol/L）总胆固醇（mmol/L）对照组 52.11±8.56 11/10 30.95±2.77 12.16±3.13 10.71±2.31 15.26±6.17 2.13±1.32 5.39±1.32研究组 48.12±9.33 13/8 31.23±2.91 5.29±1.19 4.22±1.23 9.35±3.09 2.09±1.38 5.53±1.21 P值 0.16 0.49 0.75 0.00 0.00 0.00 0.92 0.73  图1 研究样本的稀疏曲线 四、实时荧光定量PCR 通过实时荧光定量PCR发现，在门水平，研究组的厚壁菌门、拟杆菌门及放线菌门与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而变形杆菌门和梭形杆菌门差异均无统计学意义（P＞0.05）。研究组的厚壁菌门和放线菌门较对照组显著下降（P＜0.05），而拟杆菌门显著上升（P=0.00）。同时，研究组厚壁菌门/拟杆菌门比值显著下降（P=0.00）。见表4。 在厚壁菌门中，研究组的韦荣球菌属和Ⅳ型梭菌属较对照组显著上升（P=0.00），而乳杆菌属和Blautia球菌-直肠真杆菌属则显著下降（P＜0.05）。在拟杆菌门中，研究组的拟杆菌属较对照组显著上升（P=0.00），而普雷沃菌属则显著下降（P=0.01）。在放线菌门中，研究组的双歧杆菌属较对照组显著下降（P=0.00）。见表5。 表 3 研究组和对照组菌群的丰度及多样性比较  组别 Reads指数 Coverage指数 OTU Ace Chao1 Shannon Simpson对照组 23 454.33±2 224.890.998 1±0.002 1188.12±19.16 209.77±32.21 225.54±43.55 3.23±0.89 0.088 7±0.050 1研究组 22 921.45±1 258.760.997 2±0.001 8113.44±17.25 119.09±24.91 187.49±36.42 2.39±0.76 0.128 7±0.071 2 P值 0.057 6 0.143 8 0.000 0 0.000 0 0.003 8 0.002 1 0.041 5  图2 研究样本的Shannon曲线 表4 研究组和对照组肠道菌群门水平实时荧光定量PCR结果比较  组别 拟杆菌门 厚壁菌门 放线菌门 变形杆菌门 梭形杆菌门 厚壁菌门/拟杆菌门比值对照组 9.12±1.71 13.21±1.22 7.11±1.50 8.23±1.67 7.32±1.55 1.42±0.31研究组 10.87±1.84 11.97±1.13 5.98±1.43 8.51±1.81 7.47±1.58 1.12±0.23 P值 0.00 0.00 0.02 0.60 0.76 0.00 表5 研究组和对照组肠道菌群属水平实时荧光定量PCR结果比较  组别 拟杆菌属 普雷沃菌属 Ⅳ型梭菌属 乳杆菌属 韦荣球菌属 Blautia球菌-直肠真杆菌属 双歧杆菌属对照组 7.95±0.74 7.19±1.21 6.12±0.83 5.11±0.42 5.81±0.61 7.01±0.66 7.11±1.01研究组 9.21±0.66 6.23±1.13 7.59±0.64 4.19±0.37 8.91±0.78 6.32±0.91 4.81±0.83 P值 0.00 0.01 0.00 0.00 0.00 0.01 0.00 讨 论近年来，有研究认为肠道菌群的改变与包括肥胖、糖尿病等代谢性疾病及心血管疾病的发生有关联［2］。利用高通量测序技术研究肠道菌群能够克服常规培养方法的缺陷，发现低丰度细菌或未知细菌，进而可全面、准确地获得菌群的信息。国内外已有学者采用高通量测序技术对2型糖尿病患者的肠道菌群进行分析，发现2型糖尿病患者肠道菌群的种类和数量与正常人存在差异［5-6］。然而肥胖作为2型糖尿病的一个重要环境因素，上述研究并未对其进行考量和分析。因此，对患2型糖尿病的肥胖人群体内肠道菌群进行分析有一定的临床意义。 从肠道菌群群落丰度和结构上看，本研究对照组肠道菌群丰度和多样性均高于研究组。肠道菌群丰度和结构可代表消化道菌群的基本状况，本研究结果说明对照组肠道菌群的物种总数高于研究组。在一项大样本研究中，研究者利用高通量测序技术对人类肠道菌群进行分析，认为肠道菌群基因丰度可作为代谢性疾病的标志物［7］。该研究发现人群肠道细菌基因数分布呈双峰样，特别是在肥胖人群中双峰分布明显，而正常对照呈单峰样。我们推测“双峰”可能代表了不同的人群，正如本研究中研究组人群代表了“低丰度”人群，而对照组人群代表了“高丰度”人群。COTILLARD等［8］也发现了这一现象，他们同时通过饮食干预对低丰度人群进行了干预，结果显示丰度的提高伴随着代谢紊乱的改善。这些研究成果为患2型糖尿病的肥胖人群的临床治疗打开了一扇窗。 在初步了解研究对象肠道菌群的丰度和结构后，本研究进一步对肠道菌群的种群进行了分析。人类肠道菌群种类繁多，从门的水平上可分为5大类，包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门、放线菌门和梭形杆菌门，其中约90%由厚壁菌门和拟杆菌门构成。本研究结果显示，厚壁菌门和拟杆菌门是2组人群肠道中的主要菌群，只是在构成比上存在差异。定量分析结果显示，研究组拟杆菌门显著上升而厚壁菌门显著下降。在肠道菌群中，厚壁菌门和拟杆菌门比例的不平衡与许多疾病相关。有研究认为肥胖人群厚壁菌门占优势，厚壁菌门/拟杆菌门比值较高［1］；也有研究认为糖尿病患者拟杆菌门占优势，而厚壁菌门/拟杆菌门比值较低［9］。上述研究显示单纯肥胖者和糖尿病患者的肠道菌群结构存在差异，而本研究结果显示患2型糖尿病的肥胖人群似乎更倾向于糖尿病患者的肠道菌群特点。同时，本研究还发现放线菌门在2个组间也有差异（P=0.02）。 以往研究显示，肠道菌群可促进蛋白质、糖类等物质的吸收，把难吸收的多糖转变为单糖，参与胆固醇的代谢等，对肠道内营养物质的代谢具有重要的干预作用［2，10］。我们通过文献检索，对7个目标菌种利用实时荧光定量PCR进行分析，结果发现在研究组中拟杆菌属、Ⅳ型梭菌属和韦荣球菌属显著上升，而乳杆菌属、双歧杆菌属、Blautia球菌-直肠真杆菌属和普雷沃菌属则显著下降。乳杆菌属和双歧杆菌属能产生乳酸，具有益生菌的特点。动物实验结果显示，高水平的乳杆菌属和双歧杆菌属具有抵抗糖尿病的作用，而拟杆菌属和Ⅳ型梭菌属能促进糖尿病的形成［11］。细菌产生的乳酸能被肠道内另一类产丁酸的细菌利用，进而转化成丁酸［12］，丁酸能促进肠道合成黏蛋白，保护肠黏膜的完整性。Blautia球菌-直肠真杆菌属是一个主要的产丁酸菌种，而普雷沃菌属的作用主要是降解黏蛋白。拟杆菌属、Ⅳ型梭菌属和韦荣球菌属可以利用葡萄糖和乳酸最后分解成短链脂肪酸［13］，但是这些短链脂肪酸并不能合成黏蛋白，反而能导致肠道黏膜的通透性增加，促进炎症的形成［12］。这些对特定菌种的研究成果为我们利用肠道菌群靶向治疗2型糖尿病奠定了基础。 肥胖是2型糖尿病的高危因素，本研究通过对患2型糖尿病的肥胖人群的肠道菌群进行分析，发现了在此类人群中肠道菌群的一些特异性变化，为预防和临床治疗2型糖尿病拓展了视野。然而，本研究虽然考虑了饮食及体育锻炼等因素，但肠道菌群还受年龄、地域等因素影响，因此多中心、大样本的研究是非常有意义的，同时肠道菌群变化与2型糖尿病的因果关系还需进一步探索。 参考文献 ［1］LEY RE，TURNBAUGH PJ，KLEIN S，et al. 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Abstract：Objective To investigate the characteristics of gut microbiota in obese population with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 21 obese patients with type 2 diabetes mellitus（study group） and 21 obese subjects with normal glucose（control group） were enrolled. The fecal samples were collected and determined by Illumina Miseq high-throughput sequencing for the V3 region of 16S rRNA gene. The abundance and distribution were analyzed by cluster analysis. Gut microbiota was analyzed by real-time quantitation polymerase chain reaction（PCR）. Results The analysis of DNA sequence was successfully performed. The rare faction curves showed that adequate sequencing depth was achieved，and the coverage indices were ＞0.99. The Ace and Chao1 indices of study group were lower than those of control group（P＜0.05）. The Shannon index or Simpson index of study group was lower or higher than that of control group（P＜0.05）. The results of real-time quantitation PCR showed that the quantities of Actinobacteria and Firmicutes were lower（P＜0.05），while that of Βacteroidetes was higher in study group than that in control group（P＜0.05）. The quantities of Proteobacteria and Fusobacteria had no statistical significance between the 2 groups（P＞0.05）. The quantities of Veillonella，Clostridium Ⅳ and Βacteroides were higher，and the quantities of Lactobacillus，Βlautia coccoides-Eubacterium rectale，Prevotella and Βifidobacterium were lower in study group compared with those in control group（P＜0.05）. Conclusions The obese population with type 2 diabetes mellitus has low abundance and diversity of gut microbiota. The quantitation analysis of the composition of gut microbiota has a certain significance. Key words：Gut microbiota；Type 2 diabetes mellitus；Obese；High-throughput sequencing 文章编号：1673-8640（2016）010-0848-06 中图分类号：R446. 5 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.010.003 基金项目：上海市浦东新区科技发展基金项目（PKJ2012-Y20） 作者简介：曾艺鹏，男，1971年生，硕士，副主任医师，主要从事糖尿病致病机制研究。 收稿日期：（2016-03-24） |
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±s表示，进行t检验，Dice相似性系数采用UPG-MA方法计算。以P＜0.05为差异有统计学意义。
