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王 影1， 张 嵘1， 刘锦燕2， 史 册1， 李文静1， 赵 悦1， 项明洁2 （1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200020；2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020） 摘要：目的 研究锌簇转录因子——多药耐药调节因子2（Mrr2）编码基因MRR2错义突变C1409A与白念珠菌氟康唑耐药的相关性。方法 利用白念珠菌工程菌株SN152构建MRR2基因敲除菌株，通过一步法克隆及定点突变技术构建MRR2基因C1409A突变型表达质粒，再用高效醋酸锂转染法将质粒片段转染入MRR2基因敲除菌株，异位表达于ADE2位点以构建MRR2基因定点突变菌株。通过体外药物敏感性试验及实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析错义突变C1409A与氟康唑耐药的关系。结果 氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变的白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）较对工程菌株SN152的MIC增加4倍，CDR1表达上调约3倍。结论 MRR2基因错义突变C1409A可上调白念珠菌CDR1表达并介导白念珠菌对氟康唑的耐药。 关键词：白念珠菌；氟康唑；耐药；MRR2基因；错义突变 白念珠菌是临床上最常见的条件致病性真菌，广泛存在于自然界，是人体正常菌群之一，在人体免疫力低下时该菌可大量繁殖并引起疾病。唑类药物（如氟康唑）是临床治疗白念珠菌感染的一线药物，但唑类药物仅具有抑菌效果且白念珠菌对其易产生耐药性，这给临床治疗带来很大困难。多种机制参与白念珠菌对唑类药物的耐药过程［1-7］，其中锌簇转录因子作为真菌特有的转录蛋白在白念珠菌耐药方面起到关键性的核心作用［8］。有研究表明，功能获得性（gain-of-function，GOF）突变可使锌簇转录因子处于高活性状态，进而持续性上调其下游基因而介导白念珠菌耐药［4，9-11］。2013 年，有学者发现了一个新的介导白念珠菌耐药的锌簇转录因子——多药耐药调节因子2（multidrug resistance regulator 2，Mrr2），通过调控CDR1基因的表达，Mrr2可介导白念珠菌耐药［12］。然而，该研究仅仅以白念珠菌工程菌株为基础，并未对临床菌株Mrr2中可能出现的GOF突变进行进一步研究。基于先前的报道，我们对临床收集的耐氟康唑白念珠菌进行分析，利用白念珠菌基因敲除、基因定点突变及基因异位回复等技术，探索前期研究中发现的Mrr2错义突变C1409A与临床白念珠菌耐药的关系。 材料和方法一、材料 1.实验菌株与试剂 本研究使用的白念珠菌SN152菌株由第二军医大学新药研究中心实验室馈赠，质粒pCPC20由上海生命科学院生化与细胞所常鹏馈赠，质粒pGEM-HIS1、大肠埃希菌DH5α由上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科保存，DMT化学感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），ClonExpress Ⅱ一步法克隆试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），酵母菌精氨酸营养缺陷培养基及酵母菌高效转染试剂盒（北京泛基诺公司），KOD-plus高保真酶（TOYOBO公司），DpnI内切酶（碧云天生物技术有限公司），质粒DNA 小量抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 产物回收试剂盒（Biomiga公司），酵母菌RNA抽提试剂盒、PrimeScript逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex Taq 逆转录PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。 2.主要仪器 实时荧光定量PCR分析仪（ABI 7300，Applied Biosystems，美国），PCR扩增仪（S100 Thermal Cycler PCR，Bio-Rad，美国），Tanon EPS-300 水平式电泳仪和Tanon凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），SCS-24型温控摇床（上海市离心机械研究所），电热恒温水槽（上海医疗机械七厂）。 二、方法 1.构建野生型MRR2表达质粒pCPC20-T1 按照参考文献［13］中的步骤对白念珠菌工程菌株SN152基因组DNA进行提取。根据白念珠菌工程菌株MRR2基因序列（基因组序列号为NW_139645.1）设计引物MRR2-F和MRR2-R，见表1，根据质粒pCPC20序列设计引物CP-F和CP-R分别对MRR2基因和pCPC20质粒片段进行扩增。PCR采用高保真酶KOD-plus，反应体系及反应条件完全按照该酶的说明书设置。扩增产物经凝胶电泳确定条带大小正确，利用PCR 产物回收试剂盒纯化回收目的条带，再对回收产物进行DNA定量。按照ClonExpress Ⅱ一步法克隆试剂盒的标准步骤，利用10 μL反应体系取MRR2回收片段85 ng、质粒回收片段160 ng进行一步法克隆反应，连接产物利用CaCl2法转化入大肠埃希菌感受态DH5α，并均匀涂布于氨苄西林LB平板（1% NaCl、1% 蛋白胨、0.5% 酵母浸液、2% 琼脂粉、100 g/L 氨苄西林）上，37 ℃孵育16 h。挑取单克隆菌落，经LB培养液增菌培养后用质粒DNA 小量抽提试剂盒抽提质粒。用检测引物VP-F和VP-R对重组质粒进行PCR扩增，凝胶电泳确定条带大小正确后取重组质粒送测序，使用序列同源性分析软件进行测序结果与NW_139645.1的Blast比对，证实重组质粒序列正确后将重组质粒用20%甘油-20 ℃保存待用。 2.构建定点突变型MRR2表达质粒pCPC20-TM 根据MRR2序列设计C1409A定点突变引物MP-F和MP-R，利用此引物和KOD-plus高保真酶扩增pCPC20-T重组质粒，PCR反应体系和反应条件完全按照KOD-plus高保真酶说明书设置。DpnI内切酶降解甲基化质粒模板（10 μL体系）：DpnI内切酶 1 μL，10×Buffer 1 μL，重组质粒PCR产物5 μL，ddH2O 3 μL，37 ℃孵育1 h。将10 μL去甲基化产物转化入DMT化学感受态细胞，用氨苄西林LB平板筛选目的克隆。定点突变重组质粒pCPC20-T1的抽提、鉴定和测序分析同上，将证实后的质粒用20%甘油-20 ℃保存待用。 3.构建MRR2野生型、定点突变型及pCPC20质粒空载型白念珠菌S1、SM和S0 以SN152为工程菌［14］的MRR2基因敲除菌株MRR2Δ/Δ（表2）由上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科先前构建［13］。以质粒pCPC20、pCPC20-T1和pCPC20-TM为模板，UP-F和 UP-R为引物，用KOD-plus高保真酶PCR扩增野生型和MRR2定点突变型重组质粒。扩增产物用乙醇沉淀法回收。按照酵母菌高效转染试剂盒操作说明，将3种回收片段分别转染到MRR2Δ/Δ基因敲除菌株，在精氨酸营养缺陷培养基上培养48 h，挑单克隆于YPD培养基中增菌培养，抽提基因组DNA，用上、下游引物鉴定MRR2序列异位重组位置正确后PCR扩增菌株的MRR2基因，序列送测序，序列比对正确后将菌株于20% 甘油-20 ℃保存待用。 表1 引物序列  注：用“__”标识的碱基指一步法克隆中使用的5' 端重叠配对碱基；用“ __”标识的碱基指需要定点突变的碱基 引物名称引物序列（5'～3'）MRR2-FAGGTAATCATTGTCAATGACCAAACGTGATCGTACA MRR2-RCAATGGCACTACAGCGGGTTTACGAGATTTTGAGGA CP-F GCTGTAGTGCCATTGCATTGTTCACCACAAATGTTTCT CP-R TGACAATGATTACCTATGGTAGCGATGCACGGT VP-FATCCACTGTGCTCCGAAAAC VP-RTGCCTTGGGTGGCTATTTTA MP-FCCGAAGCTAGTAATGTGTTCTACAACGATTTGGTCATT MP-RTTGTAGAACACATTACTAGCTTCGGAATCAATGGTGGC UP-FTTGGACGCAGCCAAATCAC UP-RTGAGTTCAAATGGCACACCAA CDR1-FTTTAGCCAGAACTTTCACTCATGATT CDR1-RTATTTATTTCTTCATGTTCATATGGATTGA 4.药物敏感性检测 以白念珠菌（ATCC 90028）为阴性对照、克柔念珠菌（ATCC 6258）为阳性对照，采用微量肉汤稀释法检测氟康唑对SN152、MRR2Δ/Δ、S0、S1和SM菌株的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），氟康唑药板配制和结果判读按照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27-A3方案进行。 表2 各白念珠菌的基因型  注：*指以其前面的菌株基因型为基础 菌株基因型备注SN152ura3::imm434::URA3/ura3::imm434 iro1::IRO1/iro1::imm434 his1::hisG/his1::hisGleu2/leu2 arg4/arg4参考文献［14］MRR2Δ/Δ SN152*mrr2:: his1/ mrr2:: C.m leu2参考文献［13］S0MRR2Δ/Δ*ADE2/ade2:: ADH1p-PAP本研究S1MRR2Δ/Δ*ADE2/ade2:: ADH1p-MRR2SN152-PAP本研究SMMRR2Δ/Δ*ADE2/ade2:: ADH1p-MRR2C1409A-PAP本研究 5.实时荧光定量PCR 检测菌株CDR1表达参照酵母菌RNA抽提和逆转录试剂盒说明书，对菌株SN152、MRR2Δ/Δ、S0、S1和SM进行RNA抽提和逆转录。按照SYBR Premix Ex Taq 逆转录PCR扩增试剂盒说明书配制实时荧光定量PCR反应体系，引物为CDR1-F和CDR1-R，反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s、 60 ℃ 31 s，40 个循环。收集荧光阈值（cycle threshold，Ct），以白念珠菌18S rRNA为内参基因，用相对定量方式计算ΔCt（ΔCt=CtCDR1-Ct18SrRNA），各菌株CDR1表达量相对于SN152菌株CDR1表达量的倍数即为2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt构建菌株-ΔCtSN152）。 结 果一、重组质粒的构建及鉴定 在本研究中，为构建重组质粒所用的质粒载体pCPC20的结构见图1，该质粒含有ADH1启动子、ACT1终止子及精氨酸筛选标记ARG4。以CP-F/R为引物扩增质粒pCPC20，PCR扩增产物凝胶电泳鉴定见图2（a），目的条带大小为8 158 bp，位置正确。以MRR2-F/R为引物扩增白念珠菌工程菌株SN152 MRR2基因，其PCR扩增产物凝胶电泳鉴定结果见图2（b），目的条带大小为2 133 bp，位置正确。利用ClonExpressⅡ一步法克隆试剂盒构建重组质粒pCPC20-T1，使白念珠菌MRR2基因在质粒pCPC20中的ADH1启动子后表达。为验证重组质粒构建结果，用引物VP-F/R扩增重组质粒单克隆，见图2（c），目的条带大小为2 567 bp，位置正确。在挑选的4个单克隆质粒中，前3个为阳性，第4个为阴性。基因测序结果表明，重组质粒pCPC20-T1及pCPC20-TM中MRR2基因序列正确，即野生型MRR2重组质粒pCPC20-T1的序列结果与NW_139645.1基因组序列一一对应，重组质粒pCPC20-TM的MRR2序列第1409位的碱基C变成A，其余碱基与野生型一致。  图1 质粒载体pCPC20结构及重组质粒构建示意图  图2 质粒pCPC20、SN152菌株及重组质粒pCPC20-T1鉴定电泳图 注：（a）为质粒pCPC20克隆扩增电泳结果，1泳道为Marker，2、3泳道为阳性结果；（b）为白念珠菌工程菌株SN152 MRR2基因PCR电泳结果，1泳道为Marker，2～5泳道为阳性结果；（c）为重组质粒pCPC20-T1 PCR电泳结果，1泳道为Marker，2～4泳道为阳性结果，5泳道为阴性结果 二、药物敏感性及实时荧光定量PCR 氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变菌株SM的MIC较白念珠菌工程菌株SN152增高了4倍，而对MRR2基因敲除菌株的MIC值则有所降低，这与SCHILLIG等［12］的报道一致。实时荧光定量PCR结果显示，MRR2基因C1409A定点突变菌株SM的CDR1基因相对表达量大约是白念珠菌工程菌株SN152的3倍，而MRR2基因敲除菌株MRR2Δ/Δ、pCPC20质粒空载菌株S0及MRR2野生型质粒载体菌株S1的CDR1相对表达量与SN152相比均没有明显变化。见图3。  图3 各菌株对氟康唑药物的敏感性及PCR结果 讨 论白念珠菌是临床上最常见的条件致病性真菌，唑类药物尤其是氟康唑是其临床治疗应用最广的抗真菌药。由于临床长期且频繁的预防经验用药及不规范治疗，导致白念珠菌对氟康唑的敏感性下降，药物耐受现象给临床治疗带来很大困难。 目前研究证实，多种机制参与白念珠菌耐药过程，包括药物作用靶酶编码基因的突变和过表达［1］、耐药相关转录因子突变［2-4］、药物外排泵编码基因表达增多［5］、生物膜的生成［6］、细胞代谢应激反应［7］等。其中，药物外排泵编码基因表达增多使菌体内药物浓度降低是白念珠菌对唑类药物耐药的最重要机制。白念珠菌常见的药物转运蛋白家族有2种：一种是拥有ATP结合盒结构（ATP-binding cassette，ABC）的转运蛋白超家族，其编码基因主要有CDR1和CDR2；另一种是主要易化载体超家族（major facilitator superfamily，MFS），其编码基因主要是MDR1［15-16］。药物外排泵编码基因由其上游转录因子调控，如锌簇转录因子——CDR基因转录激活因子1（transcriptional activator of CDR gene 1，Tac1）调控CDR1和CDR2的表达，锌簇转录因子——多药耐药调节因子1（multidrug resistance regulator 1，Mrr1）调控MDR1的表达。近年来，由锌簇转录因子发生GOF突变致下游药物外排编码基因表达上调而介导白念珠菌对药物耐受的报道屡见不鲜，如N997D、 T225A、N972D、A736V、 R693K及 G980E等是已被报道的转录因子Tac1的GOF突变［9-10］，Mrr1的GOF突变P683S和G997V也被证实与白念珠菌耐药有关［11］。 MRR2基因位于白念珠菌第3号染色体上，其编码蛋白Mrr2是一种锌簇转录因子，之前大多数研究认为MRR2与白念珠菌的细胞黏附及菌株体内定植有关［17-19］。SCHILLIG等［12］在2013年的研究中认为Mrr2可通过调控CDR1介导白念珠菌耐药，而且Mrr2可独立介导白念珠菌对氟康唑耐药， 而Tac1在介导白念珠菌对氟康唑耐药时必须有Mrr2的参与，我们猜测临床白念珠菌耐药菌株的Mrr2中或许存在与Tac1相类似的GOF突变。在前期研究中我们发现，在CDR1高表达的氟康唑耐药临床白念珠菌中存在错义突变C1409A，而这一点突变并没有在临床氟康唑敏感菌株中出现，C1409A可能是锌簇转录因子Mrr2的GOF突变。 利用基因敲除、基因定点突变及基因异位回复等技术，我们成功构建白念珠菌MRR2基因C1409A定点突变菌株。经药物敏感性及实时荧光定量PCR检测分析，我们发现与白念珠菌工程菌株SN152相比，氟康唑对MRR2基因敲除菌株MRR2Δ/Δ的MIC下降，这与SCHILLIG等［12］的报道一致，而氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变菌株SM的MIC较对工程菌株SN152的MIC增高了4倍。实时荧光定量PCR结果显示，定点突变菌株CDR1基因相对表达量约是白念珠菌工程菌株SN152的3倍，而MRR2基因敲除菌株MRR2Δ/Δ、pCPC20质粒空载菌株S0及MRR2野生型质粒载体菌株S1的CDR1相对表达量与SN152相比均没有明显变化，这说明MRR2基因C1409A点突变与白念珠菌氟康唑耐药相关，而且其耐药机制部分依赖于CDR1基因的表达上调。 Mrr2作为一种与白念珠菌耐药相关的锌簇转录因子，目前对其研究报道较少，特别是基于临床菌株的研究较少。本研究证实C1409A突变与白念珠菌氟康唑耐药相关，并建立了白念珠菌定点突变菌株体系，为进一步研究MRR2基因与白念珠菌耐药的关系奠定了基础。 参考文献 ［1］ XIANG MJ，LIU JY，NI PH，et al.Erg11 mutations associated with azole resistance in clinical isolates of Candida albicans［J］. 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The mutated MRR2 gene was expressed at ADE2 locus using classical lithium acetate transfection method. Fluconazole susceptibility test and real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction （PCR） were performed to analyze the correlation between C1409A missense mutation in MRR2 gene and fluconazole resistance. Results The recombinant isolates contributed to an almost 3-time increase for CDR1 expression and a 4-time increase for minimal inhibitory concentration（MIC） in fluconazole resistance compared with SN152. Conclusions The C1409A missense mutation in MRR2 gene contributes to fluconazole resistance of Candida albicans with upregulating CDR1 expression. Key words：Candida albicans；Fluconazole；Drug resistance；MRR2 gene；Missense mutation 文章编号：1673-8640（2016）09-0744-06 中图分类号：R446.5 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.09.003 （收稿日期：2016-03-14） （本文编辑：姜 敏） 基金项目：黄浦区卫生局项目（2012-HGG-44）；上海市自然科学基金项目（15ZR1426900） 作者简介：王 影，女，1989年生，学士，主要从事真菌耐药机制及流行病学研究。 张 嵘，女，1967年生，学士，主管技师，主要从事临床检验诊断学工作。 张嵘与王影对本研究具有同等贡献，并列为第一作者。 通讯作者：项明洁，联系电话：021-63867643。 |
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