上海地区汉族人群STR位点的选择和优化赵慧佳1， 顾志冬1， 程蔚蔚2， 陶 炯2， 高佳琪2， 韩 旭2 （1.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025；2.中国福利会国际和平妇幼保健院，上海 200030） 摘要：目的 选择适用于上海地区汉族人群特点的常见染色体短串联重复序列（STR）位点，并将位点扩增条件优化成一个检测体系，将荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）应用于胎儿常见染色体非整倍体的快速产前诊断。方法 通过48例正常的上海地区汉族人样本的多态性分析，评估位于13、18、21、X、Y染色体上STR位点的杂合度，挑选遗传多态性高的STR位点，优化成一个检测体系，用36例样本［羊水22例、脐血9例、绒毛活检（CVS）5例］进一步评价该检测体系对常见染色体非整倍体检测的敏感性和特异性。同时与染色体核型分析结果进行比对，评价建立的检测方法的有效性。结果 采用杂合度测试从28个STR位点中优选出14个位点，分别为D13S258（0.88）、D13S305（0.90）、D13S634（0.92）、D13S742（0.83）、D18S535（0.81）、D18S1002（0.69）、D18S386（0.75）、D18S391（0.77）、D21S1435（0.75）、D21S1412（0.94）、D21S1446（0.58）、D21S1414（0.85）、DXS7132（0.77）、DXY218（0.71），与性染色体定性定量特异性非STR位点AMXY、SRY、TAF9B一同优化形成一个扩增体系。将该体系用于检测36例羊水、脐血、CVS样本，共检出35例染色体数目异常，其中21三体（Down综合征）15例、18三体（Edward 综合征）12例、13三体（Patau 综合征）4例、45，XO（Turner综合征）2例、47，XXY（Klinefelter综合征）1例、47，XYY（Super-Man综合征）1例；余下1例为46，XX（正常女性）。QF-PCR结果与核型分析结果完全一致。结论 14个STR位点在上海地区汉族人群中呈现较高的遗传多态性，与性染色体定性定量位点共同构成一个QF-PCR检测体系，能准确检测13、18、21、X、Y染色体的非整倍体。QF-PCR技术能够快速、准确、经济、高效地应用于上海地区汉族人群常见非整倍体的快速产前诊断。 关键词：短串联重复序列；杂合度；产前诊断；染色体非整倍体 染色体数目异常既可以造成出生前缺陷，又可以造成出生后缺陷，严重影响了胎儿各器官的生长发育，降低了人口出生素质。随着医疗检测技术的提高和“十二五规划”中实施优生促进工程、提高出生人口素质的规划，对染色体异常进行产前诊断显得尤为重要［1］。 采用荧光定量聚合酶链反应（quantitation fluorescence polymerase chain reaction，QFPCR）检测常见染色体非整倍性的临床可行性已经被大量的文献报道［2］，且已在临床上广泛开展，但普遍存在特定染色体短串联重复序列（short tandem repeat，STR）位点选择不统一、特定染色体STR位点选择效果未经过验证、QFPCR不能在一个聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系中涵盖所有STR位点等缺点。我们选择适用于汉族人群特点的常见染色体STR位点，并对位点扩增条件进行优化，建立一个PCR体系，并应用于胎儿常见染色体非整倍体的快速产前诊断。 材料和方法一、 研究对象 收集2012年1至12月中国福利会国际和平妇幼保健院产前诊断中心遗传咨询门诊的咨询者，从汉族人群中随机抽取48名正常且无血缘关系的个体。 收集2014年1月至2015年6月中国福利会国际和平妇幼保健院产前诊断中心进行侵入性诊断的孕妇，从汉族人群病例中抽取36例孕妇进行QF-PCR验证，其中35例核型结果为阳性，1例为正常。36例孕妇的样本包括羊水22例、脐血9例、绒毛活检（chorionic villus sample，CVS）5例。产前诊断指征：孕妇Down综合征血清学筛查阳性，B超显示胎儿发育异常，无创DNA提示异常，颈项透明层增厚，高龄和既往染色体异常患儿生育史。所有孕妇行羊膜腔穿刺前均已签署知情同意书。 二、 取材 采用肝素钠抗凝管采集所有对象清晨空腹肘静脉血5 mL。羊水、绒毛、脐血穿刺方法参照参考文献［3-5］。 三、方法 1.位点选择、优化及PCR检测体系的建立 查询PubMed和万方数据库2000年1月至2014年12月已发表的文献［6-11］，收集在产前诊断中应用QF-PCR技术提及的STR位点。根据文献报道，选择参与国家范围最广、涉及病例数目最多、研究时间长的文献报道中所涉及的28个STR位点作为备选位点。采用PCR扩增48例正常样本，进行分型，得出28个多态序列位点的杂合度及等位基因数的信息。根据分型结果，选出等位基因数及杂合度相对较高的位点，调整引物位置，组成新的引物组；对最终的引物组进行多重体系优化，达到各目标峰峰高一致，无明显杂带；最终确定体系，建立一步法QF-PCR体系。 2.QF-PCR操作步骤 （1）DNA提取：采用核酸提取或纯化试剂盒（重鼎生物技术有限公司）提取DNA。（2）引物设计：引物扩增13、18、21、X染色体的14个STR位点和3个性别鉴定非STR位点，见表1。引物由天昊生物医药科技（苏州）有限公司合成。采用多重PCR反应体系，扩增产物用荧光毛细管电泳分离。（3）反应体系：每个反应量为20 μL，包括12.28 μL 去离子水、2 μL 10×Buffer、2.4 μL dNTP、1.2 μL MgCl2、1 μL引物、1 μL模板（20 ng/μL）、0.12 μL Taq扩增酶。17对引物为1组样本同时反应，在PE9700 PCR仪（美国ABI公司）上进行扩增。反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性94 ℃ 20 s，退火65 ℃ 40 s（每循环退火温度降1 ℃），延伸68 ℃ 2 min，共7个循环；变性94 ℃ 20 s，退火65 ℃ 30 s，延伸68 ℃ 2 min，共28个循环；72 ℃ 延伸2 min，4 ℃保存。扩增产物采用荧光毛细管电泳，95 ℃变性5 min后用ABI测序仪测序。（4）QF-PCR结果判读：采用GeneMapper软件对结果进行片段分析。根据国际公认的判读标准［12］，异常判读的标准为双峰面积比（高峰面积/矮峰面积）＞1.8或＜0.65，或出现3个面积大小相当的等位基因峰（1∶1∶1）。每条染色体需要2个以上的有效位点才能判读为异常峰。 表1 14个STR位点及3个性别鉴定位点的引物序列  产物长度范引物结合的模板DNA序列1（5'～3'）引物结合的模板DNA序列2（5'～3'）围（bp）1 TAF9BX/3蓝色116～121GCCTAGGTTCTAGTCCTAGCTCCATCA ACCTACCCTGCCTACCTCACAGG 2 D13S74213蓝色219～289CCAGATAACTGGGCTAGGAATGGATGAATGCAAATTCTCTGGCCC 3 DXS7132X蓝色299～359ACCACTCCTGGTGCCAAACTCTAGAATATGGGGAGCCGCTCATG 4 D21S144621蓝色379～429TTTGGTCAATGGCAGATTGCATATAGCCTCGAGCAGGTCCTTTG 5 D18S39118绿色149～181CCCAGTTAGACTTCACTATTCCCATCTTTCCTCAAGTCACATTGCCTGTG 6 AMXYX/Y绿色189～199GGCACCCTGGTTATATCAACTTCAGCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATG 7 D13S25813绿色209～285GGAGGAGAGGGACTACCCAGACATTGGTTTATTCCCTCTCTCTGTCTTCC 8 D21S141421绿色379～425TGGTCTGTTATGGGACTTTTCTCAGTCTTTTTACTGGGTGCCAGACACTAATT 9 D13S30513绿色439～509ATGCAAGGAAATTTGTGGTTATAGAGC ATTCGTAACGACAGGTCCTCAAACA 10 DXYS218 X/Y黑色119～155GCGAAACTCCGTCTCAAAATAAATACA CAGTTGGCACGCCTGACTTCTT 11 D21S143521黑色166～210CCCATTCCCCTCTCCAATTGTTTTGATGGCACTGAAATCTCTTGC 12 D21S141221黑色260～320TGCTTCACATGTTTTCTTGACACAGCAACTCACTGCAACCTCCGC 13 D18S100218黑色379～419TTAGGGCATTGAGGCGTTTGATATGTCTCCTGGCCTTTGCTCAG 14 SRYY红色129-～33TTGCACTTCGCTGCAGAGTACCTTTCTCTCTGTGCATGGCCTGT 15 D18S53518红色151～201TGTGACAAAAGCCACACCCATAATTATGGGTAACTCTTAGCCTGCCA 16 D13S63413红色389～436TCCATTGCCCTATCTTTAAGTTTGCGGAAAGCCAGTAGTGTGGCAACAT 17 D18S38618红色472～555GCTGAGTCAGGAGAATCACTTGGAAC GCATTAGGGTCTAAAATGTGCAATGT序号探针对名称染色体荧光标记 3.染色体核型分析 各种样本按照遗传实验室常规培养，制片，G显带，参照《人类细胞遗传学国际命名体制》标准［13］进行核型分析 。 结 果一、优选STR位点并建立体系 采用杂合度测试从28个STR位点中优选出14个位点，分别为D13S258（0.88）、D13S305（0.90）、D13S634（0.92）、D13S742（0.83）、D18S535（0.81）、D18S1002（0.69）、D18S386（0.75）、D18S391（0.77）、D21S1435（0.75）、D21S1412（0.94）、D21S1446（0.58）、D21S1414（0.85）、DXS7132（0.77）、DXY218（0.71）。将所选的14个染色体STR位点与性染色体定性定量特异性非STR位点AMXY、SRY、TAF9B一同优化形成一个PCR扩增体系。见表2。 二、QF-PCR结果和核型分析结果的一致性 使用35例核型结果为阳性和1例核型结果为正常的样本验证本研究建立的QF-PCR体系。36例样本采用QF-FCR检测共检出21三体（Down综合征）15例、18三体（Edward 综合征）12例、13三体（Patau 综合征）4例、45，XO（Turner综合征）2例、47，XXY（Klinefelter综合征）1例、47，XYY（Super-Man综合征）1例和46，XX（正常女性）1例，与核型分析结果完全一致。QF-PCR对13、18、21、X和Y染色体的非整倍体检出率为100%，染色体的数目异常无假阳性结果；对染色体13、18、21、X和Y非整倍体检测的特异性为100%。图1为1例21三体（Down综合征）的男性胎儿羊水样本PCR产物的毛细管电泳结果；图2为同一样本染色体分析结果，为47，XY，+21。 表2 28个STR位点多态性序列的检测  Chr13D13S628 70.6713q31-q32 Chr21D21S1437 80.4821q21.1 D13S742 60.8313q12.12D21S1446 80.5821q22.3-ter D13S631170.8513q31-32D21S1809 90.7321q22.1 D13S258110.8813q21D21S1435 70.7521q21 D13S305110.9013q12.1-13q14.1D21S1411 80.8121q22.3 D13S634130.9213q14.3D21S1414100.8521q21 Chr18D18S390 50.5618q22.2D21S1412160.9421q22.2 D18S858 40.5818q21.1ChrX/YHPRT 50.60Xq26.1 D18S1002 50.6918q11.2DXS6803 70.67Xq12-Xq21.33 D18S386160.7518q22.1SBMA150.77Xq11.2-Xq12 D18S391 40.7718pter-18p11.22DXS6809 70.85Xq D18S535 80.8118q12.2DXS8377150.90Xq28 D18S499 90.8318q21.32-q21.33DXYS218 50.71Xp22.32 Yp11.3（PAR1）X22 70.79Xq28 Yq（PAR2）DXS7132 60.77Xq12染色体STR位点等位基杂合度染色体位置染色体STR位点等位基杂合度染色体位置因数因数  图1 21三体（Down综合征）男性胎儿羊水样本PCR产物的毛细管电泳结果 注：蓝色荧光峰，自左到右依次为TAF9B、D13S742、DXS7132、D21S1446；绿色荧光峰，自左到右依次为D18S391、AMXY、D13S258、D21S1414、D13S305；黑色荧光峰，自左到右依次为DXYS218、D21S1435、D21S1412、D18S1002；红色荧光峰，自左到右依次为SRY、D18S535、D13S634、D18S386。红色框标记的21号染色体荧光峰D21S1446、D21S1414、D21S1435、D21S1412依次显示面积比分别为2∶1、2∶1、2∶1、1∶1∶1，4个STR位点均显示异常，提示21三体（Down综合征）  图2 21三体（Down综合征）男性胎儿染色体核型分析 注：框中21号染色体有3条，比正常核型多了1条，核型分析结果为47，XY，+21，提示21三体 讨 论目前，有一些研究者认为，对于血清学筛查高风险或者超声检查异常的孕妇，在得到QFPCR阳性结果时可以不必等待常规的遗传学检查结果，直接终止妊娠［6，14］。在QF-PCR中，多态性STR位点的杂合度、多态信息含量和基因频率等参数会因样本来源或人群的不同而有所差异。这种差异体现在不同地区和不同种族中，代表着某一种族和人群的特点，是快速基因诊断的前提条件。 QF-PCR是一种通过对STR位点进行扩增，进而对染色体拷贝数目异常进行检测的方法。本研究根据汉族人群的STR多态性，优选了14个STR位点，分别为D13S258、D13S305、D13S634、D13S742、D18S535、D18S1002、D18S386、D18S391、D21S1435、D21S1412、D21S1446、D21S1414、DXS7132、DXY218。其中13个STR位点在初筛位点中选择，其杂合度较高，均在0.70以上，而D21S1446（0.58）替换了初筛中的D21S1411（0.81）。虽然D21S1411的杂合度高于D21S1446，但考虑到实验的便捷程度、经济成本和样本数量因素，通过优化位点，将所有引物组合成一个混合物，避免多次移管，简化操作流程，建立一个PCR体系。原定的D21S1411位点的滑移峰较高，会影响结果判读，因此改用杂合度相对不高，但结合率高的D21S1446。本研究所选的STR位点可以提供丰富的汉族人群遗传信息，以此为基础建立的QF-PCR体系适用于汉族人群常见的染色体STR位点。本研究建立的QF-PCR体系采用1管多重PCR的方法，选择杂合度高的STR位点，优化体系，反应体系中包含针对13、18、21、X和Y染色体设计的17对分别以四色荧光标记的引物，达到了欧美各国对QF-PCR体系中每个染色体至少检测4个位点的要求，而且本研究尽可能地使用多个STR位点，以提高对染色体非整倍体疾病的诊断率。 本研究结果与其他诊断中心的调查基本一致［2，6，14］，而且建立的QF-PCR体系可以检测绝大多数染色体异常的产前诊断样本。因本研究样本量不足，尚不能深入分析QF-PCR技术对嵌合体、嵌合体比例以及母血污染的诊断价值。 QF-PCR是一种快速、简便、准确的诊断试验。将QF-PCR技术用于产前诊断，既可以解决人口众多、样本量巨大的困难，也可以解决因资金短缺和缺乏专业技术人员导致的产前诊断难以大面积普及的障碍。 参考文献 ［1］池一婵，隗伏冰，刘彦慧. 畸形胎儿的产前实验室诊断研究进展［J］. 中国当代医药，2015，22（10）：14-17. ［2］CIRIGLIANO V，VOGLINO G，MARONGIU A，et al. 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Selection and optimization of STR for Shanghai Han population ZHAO Huijia1，GU Zhidong1，CHENG Weiwei2，TAO Jiong2，GAO Jiaqi2，HAN Xu2. Abstract：Objective To select common chromosome short tandem repeat（STR） for Shanghai Han population，and to optimize the site amplification conditions into a determination system. Quantitation fluorescence polymerase chain reaction（QF-PCR） will be used for the rapid prenatal diagnosis of fetal common chromosome aneuploidies. Methods Through the polymorphism analysis of 48 healthy Han population in Shanghai，STR heterozygosities on 13，18，21，X and Y chromosomes were evaluated. STR with high polymorphism was selected and optimized into a determination system，and the sensitivity and specificity were evaluated in the determination system by 36 samples ［22 cases of amniotic fluid，9 cases of cord blood and 5 cases of chorionic villus samples（CVS）］. Chromosome karyotype analysis was performed simultaneously，and the effectiveness of the established method was evaluated. Results A total of 14 STR were selected in STR heterozygosity test，and they were D13S258（0.88），D13S305（0.90），D13S634（0.92），D13S742（0.83），D18S535（0.81），D18S1002（0.69），D18S386（0.75），D18S391（0.77），D21S1435（0.75），D21S1412（0.94），D21S1446（0.58），D21S1414（0.85），DXS7132（0.77） and DXY218（0.71），together with sex chromosome ofqualitative and quantitative specific STR of AMXY，SRY and TAF9B into optimizing an amplification system. The system was used to determine 36 samples of amniotic fluid，cord blood and CVS. There were 35 cases with abnormal chromosome numbers，including 15 cases of trisomy 21（Down's），12 cases of trisomy 18（Edward），4 cases of trisomy 13（Patau），2 cases of 45，XO（Turner），1 case of 47，XXY（Klinefelter） and 1 case of 47，XYY（Super-Man）. The remaining 1 case was 46，XX（healthy female）. The results of QF-PCR were as same as the results of chromosome karyotype analysis. Conclusions Selected 14 STR show high polymorphism in Shanghai Han population，and sex chromosome qualitative and quantitative specific STR constitute a QF-PCR determination system，which can accurately determine 13，18，21，X and Y chromosome aneuploidies. QF-PCR is a rapid，accurate，economic and efficient method for the rapid prenatal diagnosis of fetal common chromosome aneuploidies in Shanghai Han population. Key words：Short tandem repeats；Heterozygosity；Prenatal diagnosis；Chromosome aneuploidies 文章编号：1673-8640（2016）09-0787-05 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.09.012 （收稿日期：2016-03-06） （本文编辑：龚晓霖） 基金项目：2014年交通大学医学院潜力学科（围产医学）项目 作者简介：赵慧佳，女，1984年生，硕士，技师，主要从事遗传学疾病研究。 通讯作者：顾志冬，联系电话：021-64370045。 |
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