血清尿酸测定的基质效应张江涛， 曾 洁， 马 嵘， 赵海舰， 周伟燕，张天娇， 闫 颖， 胡翠华， 汪 静， 王冬环， 张传宝 摘要：目的 检测21种样本（血清及制备物）的尿酸水平，评价其对13种尿酸常规检测系统的基质效应。方法 根据卫生行业标准WS/T356-2011，以同位素稀释液相色谱串联质谱法（ID-LC/MS/MS）为比对方法，将不同厂商生产的13种尿酸检测试剂盒（均为酶法）分别与日立7180全自动生化分析仪组成常规检测系统，并以此为评价方法。样本包括4种校准品、5种室间质量评价（EQA）样本、6种质控品、3种制备物（1种猪血清和2种水溶液制备物）、1种美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准参考物质（SRM）909c、2种国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）检验医学参考实验室外部质量评价计划（RELA）样本，共计21种。用比对方法和评价方法分别测定40份新鲜冰冻血清和上述21种样本。将比对方法和评价方法尿酸测定结果进行直线回归分析，求得Y预测值双侧95%可信区间，评价血清及制备物的基质效应。结果 21种评价样本中有5种基质为新鲜血清或冻干血清的样本（2种EQA正确度验证血清、2种RELA样本和SRM 909c）在所有常规检测系统中均未观察到基质效应。2种校准品（朗道和迪瑞）仅在1种常规检测系统中有基质效应。5种EQA样本中除用于正确度验证的新鲜血清样本外，其他冻干血清样本在较多常规检测系统中存在基质效应。6种质控品中有4种在所有常规检测系统中无基质效应，2种高值质控品显示负基质效应。结论 新鲜血清基质样本是可靠的检测样本，可在标准物质制备、质控品制备和EQA中使用。某些校准品在非配套系统中可能存在基质效应而产生校准偏差，因此在使用这些校准品前最好经过基质效应评价或方法验证。 关键词：尿酸；基质效应；酶实验；同位素标记；液相色谱；串联质谱法 血清尿酸是嘌呤代谢的产物，是诊断和监测高尿酸血症的指标。目前，尿酸检测的常规方法主要是酶法。但其校准品各不相同，部分厂家使用其他厂家提供的多项复合校准品，某些厂家使用配套提供的单项校准品。因此，校准品的制备及互通性仍然是值得关注的问题。校准品在应用于某一测量系统前需要用参考测量程序通过连续无间断的溯源链赋值。由于校准品是制备物，其基质效应可能在未经验证的检测系统中产生校准偏差。此时，校准品就不能直接应用在当前使用的常规方法中，需要通过参考测量程序重新确定、校正和转移量值。因而，以参考测量程序为比对方法，使用覆盖生理和病理浓度的新鲜血清修正校准品赋值是必要的步骤。我们根据国家卫生行业标准WS/T356-2011［1］，以尿酸候选参考测量程序为比对方法［2］，评价了21种血清及制备物在13种尿酸常规检测系统上的基质效应，目的是确定常用多项校准品中的尿酸项目是否可以直接应用在常规方法中以及这些制备物在常规方法中有无基质效应，是否可以直接用作参考物质或校准品。 材料和方法一、 血清和制备物 1. 血清样本 2014年1月1日至6月30日在北检验科收集40份新鲜人血清样本，尿酸浓度范围为81.8～940.6 μmol/L，编号为S1～S40。新鲜人血清收集后分装，置-80 ℃保存，保存时间不超过1周。 2. 评价样本 21种血清及制备物包括：（1）4种校准品，均为冻干血清校准品，编号1～4，分别由长征、迪瑞、朗道和罗氏公司提供，所有校准品均为4 ℃保存；（2）5种室间质量评价（external quality assessment，EQA）样本，EQA1～EQA3为2013年全国常规化学EQA样本，基质是冻干血清；EQA4和EQA5为正确度验证样本，EQA5为添加纯度标准物质的高值血清；（3）6种质控血清，为朗道、SERO和TRINA公司提供的低值和高值多项冻干质控血清；（4）3种其他基质材料的制备物，制备物1为猪血清基质，制备物2和3为水基质单项溶液，制备物2溶剂为含甘油水溶液，制备物3溶剂为含2-苯乙醇水溶液；（5）美国国家标准与技术研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）的标准参考物质（standard reference material，SRM）909c，为新鲜冰冻血清，-80 ℃保存；（6）国际临床化学与检验医学联合会（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）检验医学参考实验室外部质量评价计划（the External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）样本，为冻干品，代号分别为RELA-A、RELA-B，按照说明书复溶后使用。 二、比对方法和评价方法 1. 比对方法（参考方法） 参考方法为同位素稀释液相色谱串联质谱法（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS）。仪器系统包括Agilent 1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（美国Agilent公司）、API 4000串联三重四极杆质谱仪和Analyst 1.4.2数据处理软件（美国Applied Biosystems公司）。样本制备使用的主要仪器包括涡旋振荡器及氮气吹干装置（美国Pierce公司）。用于配制标准溶液的尿酸标准物质为NIST SRM 913a，认定纯度为（99.6±0.1）%。内标为［1，3］-15N2尿酸（标示同位素丰度为98%，美国Cambridge Isotope Laboratories公司）。有机溶剂乙腈、三氯甲烷均为色谱级，购自美国Fisher公司。采用IDLC/MS/MS检测血清尿酸作为比对方法［2］，在样本二次净化的过程中，2 mmol/L氨水复溶残渣后混匀静置1 h以上，充分溶解，加入氯仿后轻轻摇晃安瓿瓶，混匀净化，部分仍然显示碱性的样本用同浓度甲酸中和。 2. 评价方法（常规检测系统） 选取和光、积水、德赛、利德曼、九强、罗氏、美康、迈克、迈瑞、中生、迪瑞、长征和科华公司生产的13种尿酸试剂盒（酶法），分别编号为方法1～13，在日立7180全自动生化分析仪上按照试剂厂家提供的参数设置和测定。 三、评价过程 1. 样本准备过程 校准品、EQA和RELA冻干血清按照说明书要求加入适量纯水复溶，新鲜血清和溶液制备物检测前从-80 ℃取出，所有样本置于摇床上平衡至室温。 2. 评价方法测定 将21种评价样本随机插入40份血清样本中，用13种常规系统分别测定所有样本。重复测定3批，每批每份样本测定1次，每次测定前用配套校准品校准。 3. ID-LC/MS/MS分析 使用ID-LC/MS/MS定量测定血清尿酸。测定样本包括所有新鲜冰冻人血清和21种评价样本，重复测定3批，每批每份样本测定1次，将新鲜冰冻人血清和评价样本按随机原则穿插测定。 三、统计学方法 采用微软Excel 2007软件进行统计分析。按照国家卫生行业标准WS/T356-2011进行基质效应评价。将新鲜冰冻血清比对方法测定结果（X）与待评方法结果（Y）进行线性回归分析，计算相应X值下的Y预测值及其双侧95%可信区间。将21种评价血清及制备物的Y值与预测值比较以计算基质偏差，与可信区间比较以评价基质效应。 结 果21种血清及制备物在13种尿酸常规检测方法上的基质效应表现不同。未做添加或其他处理的冻干或新鲜血清在大部分常规检测系统中无基质效应，为了实现预定目标而做处理的样本基质效应比较明显。各种样本在13种常规检测方法上的基质效应见表1。 4种冻干血清多项校准品表现不同，校准品2和3只在1种常规检测系统中存在基质效应。校准品1在9种常规检测系统中无基质效应，在其他4种常规检测系统中有负基质效应，平均基质偏差为-4.4%（范围为-2.2%～-6.3%）；校准品4对9种常规检测系统有负基质效应，平均基质偏差为-7.0%（范围为-1.9%～-12.6%）。 EQA冻干血清在大多数常规检测系统中基质效应明显。EQA1对9种常规检测系统表现为正基质效应，平均基质偏差为18.9%（范围为7.8%～24.2%），EQA2和3分别在7种和12种常规检测系统中存在负基质效应，平均基质偏差为-6.2%（范围为-3.2%～11.5%）；EQA4为正确度验证新鲜血清，仅在1种常规检测系统中显示负基质效应，基质偏差为-0.9%；EQA5为正确度验证新鲜血清添加纯度物质高值血清，在5种常规检测系统中显示为负基质效应。 6种质控品中有4种在所有常规检测系统中无基质效应。质控品4在3种常规检测系统中存在负基质效应，平均基质偏差为-2.5%（范围为-1.3%～-3.2%）；质控品6在10种常规检测系统中有负基质效应，平均基质偏差为-7.7%（范围为-41.6%～0.7%）。 制备物1仅在1种常规检测系统中有正基质效应。制备物3在11种常规检测系统中有正基质效应，平均基质偏差为8.7%（范围为3.1%～13.6%）。制备物2、SRM 909c、RELA-A、RELA-B在所有常规检测系统中均无基质效应。各样本在所有常规检测系统中的基质偏差见表2。 表1 21种评价样本在13种常规检测系统上的基质效应  注：“+”表示正基质效应；“-”表示负基质效应；“N”表示无基质效应 样本常规检测系统1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13校准品1- N N - N N N - - N N N N校准品2N N N - N N N N N N N N N校准品3N N N N N N N N N N N N -校准品4N N - - - - N - - - N - -EQA1 + + + N N + + + N + N + + EQA2 N - - - N N N - - N N - -EQA3 - - - - - - - - - N - - -EQA4 N N N N N N N N N N N N -EQA5 - N N - N - - N N N N N -质控品1N N N N N N N N N N N N N质控品2N N N N N N N N N N N N N质控品3N N N N N N N N N N N N N质控品4N N - N N - N - N N N N N质控品5N N N N N N N N N N N N N质控品6N - - - - - - N - N - - -制备物1+ N N N N N N N N N N N N制备物2N N N N N N N N N N N N N制备物3+ N + + + + N + + + + + + SRM 909cN N N N N N N N N N N N N RELA-A N N N N N N N N N N N N N RELA-B N N N N N N N N N N N N N 表2 21种评价样本在13种常规检测系统上的基质偏差 （%）  样本 靶值（μmol/L）常规检测系统1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13校准品1 380.0 -5.0 -6.5 -1.9 -7.5 -1.7 -0.8 -4.1 -1.6 -5.1 -2.9 -6.2 -4.6 -11.1校准品2 376.0 -3.5 -5.9 -0.8 -6.1 -1.0 0.3 -3.2 -0.8 -4.4 -2.1 -5.9 -4.4 -11.0校准品3 376.6 -2.0 -6.2 0.7 -5.4 -0.8 0.8 1.1 0.4 -3.4 -1.0 -6.3 -3.6 -16.3校准品4 366.2 -1.3 -5.6 -7.2 -13.8 -9.0 -1.6 -2.8 -3.2-11.3 -4.6 -9.4 -9.0 -14.2 EQA1 127.4 24.7 13.8 18.4 6.6 21.6 27.3 23.4 25.6 11.9 24.2 17.9 19.7 8.5 EQA2 330.2 -3.8 -7.9 -4.0 -10.6 -4.8 -1.2 -4.8 -2.3 -9.2 -3.7 -7.4 -7.2 -13.4 EQA3 567.0 -3.6 -5.5 -4.0 -12.6 -6.4 -0.5 -4.0 -2.5-11.0 -3.9 -7.1 -10.6 -14.0 EQA4 341.5 -1.8 -3.2 -0.5 -4.3 -1.5 1.5 -1.7 0.9 -1.5 -0.4 -5.8 -3.0 -8.3 EQA5 678.1 -2.0 -4.5 0.0 -4.4 -0.1 0.7 -2.2 0.3 -1.9 -1.0 -6.1 -2.1 -9.8质控品1 349.6 -3.7 -5.5 -1.3 -6.0 -1.0 0.4 -3.2 -0.4 -4.9 -1.8 -6.1 -3.7 -11.3质控品2 559.8 -2.2 -2.8 -0.4 -3.7 -1.4 1.7 0.4 0.1 -2.3 -1.3 -4.8 -1.9 -9.3质控品3 305.5 -3.5 -4.5 -1.2 -3.8 1.5 0.2 -2.3 -0.8 -3.0 -2.2 -5.3 -0.1 -9.5质控品4 649.7 -1.9 -4.0 -0.8 -3.8 -1.2 0.6 -0.9 -1.0 -2.3 -2.3 -5.2 -2.3 -9.1 续表2 （%）  样本 靶值（μmol/L）常规检测系统1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13质控品5 101.4 1.7 -8.3 -0.7 -5.0 12.7 -0.8 7.7 -0.1 1.3 -1.4 3.2 7.3 -15.8质控品6 923.0 1.3 -8.4 -0.4 -6.3 -4.4 -0.5 -21.9 2.0 -2.1 0.6 -4.8 -8.3 -49.0制备物1 30.6 100.5 -13.7 -7.6 -19.0 5.9 3.3 38.3 9.7-19.9 8.4 -21.5 5.0 -35.0制备物2 261.0 1.2 -2.8 0.9 0.5 6.9 4.1 2.0 2.6 1.2 1.3 0.1 5.7 -6.6制备物3 399.3 10.5 1.3 10.2 10.8 13.7 9.2 5.7 10.0 10.6 8.7 7.8 13.7 -1.2 SRM 909c 278.4 -0.5 -3.6 2.5 0.9 4.4 0.5 -0.3 0.0 -1.8 -1.4 -2.4 1.4 -5.4 RELA-A 232.1 0.2 -4.5 -0.1 -2.9 3.6 1.1 0.9 -0.3 -2.0 -1.6 -4.0 2.2 -7.8 RELA-B 456.5 -0.1 -2.6 0.7 -2.4 1.1 2.1 1.6 0.6 -0.3 -0.8 -4.2 1.2 -7.3 讨 论在临床实验室的质量管理中，正确校准测量系统、选择适当的质控品及EQA样本是质量保证的重要手段。常规方法可以通过与参考测量程序比对验证该方法的正确度。在实施上述过程时，要求传递数据信息的材料在不同的测量系统中不存在不同的基质效应，或者基质效应被量化而得到修正。这些材料包括常用校准品、质控品、EQA样本和参考物质等。它们在常规测量程序中产生的基质效应已被广泛关注。本课题组已评价了胆固醇［3］、总甘油［4］、尿素［5］和肌酐［6］等的常见材料的基质效应，本研究使用候选参考测量程序评价了尿酸的基质效应。 本研究结果显示校准品2和3（迪瑞和朗道）只在1种常规检测系统中存在负基质效应，表明其适用于大多数常规检测系统。而常用的复合校准品4（罗氏）对大多数常规检测系统存在负基质效应，提示将其直接应用于其他测量系统是不可取的。因此，我们认为只有经过基质效应评价的校准品才能用于其他测量系统的校准。 EQA样本除了EQA5（新鲜血清材料）外，其他EQA样本在多数常规检测系统中都存在基质效应，但由此引起的偏差并不是很大，符合之前对EQA样本质量的判断，同时也提示在EQA活动中，以新鲜血清为样本的正确度验证方式优于使用冻干血清样本的传统方式。评价样本中质控品除了高值样本，其余样本对所有常规检测系统均无基质效应，提示添加待测物达到高值的方式可能改变样本的基质条件，引起一定的测定偏差。无基质效应的制备物可候选作为参考物质制备材料，其稳定性尚需进一步研究。 综上所述，在保证尿酸检测质量方面，校准对于测量结果的影响较大。因此，在使用校准品时最好了解其适用性或基质影响方面的信息。用于EQA的冻干材料可能在常规测量程序上出现测量偏差，虽然其偏差一般在质量指标允许范围内，但在发放EQA样本前也应评价其基质效应。 参考文献 ［1］ 张传宝，闫颖，周伟燕，等. WS-T356-2011 基质效应与互通性评估指南［S］. 北京：中国标准出版社，2011. ［2］ 张传宝，张江涛，张天娇，等. 同位素稀释液相色谱串联质谱法测定人血清尿酸［J］. 检验医学，2009，24（12）：878-882. ［3］ 赵海舰，周伟燕，张传宝，等. 血清总胆固醇测定的基质效应研究［J］. 现代检验医学杂志，2009，24 （3）：5-9. ［4］ 周伟燕，赵海舰，张江涛，等. 血清总甘油测定基质效应的研究［J］. 中华检验医学杂志，2008，31 （5）：568-573. ［5］ 赵海舰，张天娇，张传宝，等. 血清尿素测定的基质效应研究［J］. 中华检验医学杂志，2008，31 （3）：270-275. ［6］ 张传宝，陈忠余，马嵘，等. 血清肌酐测定的基质效应研究［J］. 中华检验医学杂志，2009，32 （5）：515-520. Matrix effect on serum uric acid determination ZHANG Jiangtao，ZENG Jie，MA Rong，ZHAO Haijian，ZHOU Weiyan，ZHANG Tianjiao，YAN Ying，HU Cuihua，WANG Jing，WANG Donghuan，ZHANG Chuanbao. Abstract：Objective To evaluate the matrix effect of 21 samples （sera and processed materials） on 13 routine determination systems in serum uric acid determination. Methods Determinations were performed according to the health industry standard WS/T356-2011. Isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry （ID-LC/MS/MS）was used as comparison method，and 13 kinds of uric acid kits（enzymic assay） were chosen as evaluation method with HITACHI 7180 analyzer. The 21 samples included 4 calibrators，5 kinds of external quality assessment（EQA） samples，6 kinds of quality control materials，3 processed materials （1 kind of spine serum and 2 kinds of liquid solutions），1 kind of standard reference material（SRM） 909c from the National Institute of Standards and Technology （NIST）and 2 kinds of the External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine （RELA）samples from the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine（IFCC）. A total of 40 fresh frozen sera and the 21 samples were analyzed by comparison method and evaluation method. The results obtained by the 2 methods were analyzed by linear regression analysis. Two-tailed 95% confidence intervals for Y predictive value were computed，and the matrix effect of sera andprocessed materials was evaluated. Results A total of 5 kinds of evaluation samples （2 EQA samples，1 SRM 909c and 2 RELA samples）from fresh or lyophilized sera showed no matrix effect in all routine methods. Two calibrators （Landau and Dirui） showed matrix effect in 1 routine method. Of 5 EQA samples，except for fresh sera used for trueness verification，other lyophilized sera showed matrix effect in most routine methods. The 4 of 6 quality control materials showed no matrix effect，and 2 quality control materials with high values showed negative matrix effect. Conclusions Fresh serum is a reliable sample and could be used in SRM and quality control material preparation and EQA. Some calibrators could introduce calibration bias due to matrix effect on non-matching routine methods. Thus，matrix effect evaluation and methodological verification are proposed prior to using non-matching calibrators. Key words：Uric acid；Matrix effect；Enzymic assay；Isotope dilution；Liquid chromatography；Tandem mass spectrometry （收稿日期：2015-09-02） （本文编辑：龚晓霖） 基金项目：国家卫生和计划生育委员会科技基础性工作专项项目（2013FY113800） 作者简介：张江涛，男，1977年生，硕士，助理研究员，主要从事临床检验标准化研究。 通讯作者：张传宝，联系电话：010-58115059。 |
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