PCR的这些小知识，您都知道吗？

stingray928 2017-06-13

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开篇之前先问个小问题

您知道PCR的中文全称是什么吗？

”

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这是小编参加研究生面试时导师问的第一个问题，当时简直不敢相信自己的耳朵。如果您和我一样有片刻的犹豫，请备好小板凳，我们一起回顾一下简单PCR中那些需要我们了解的小知识。

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PCR基础知识

PCR（Polymerase Chain Reaction），中文全称为聚合酶链式反应，是分子生物学研究中最为广泛应用的技术。在70年代的时候首次报道使用聚合酶及合成引物进行单链DNA的扩增，但直到1983年才正式作为一种研究工具用于DNA的扩增。自此以后，PCR成为分子生物学研究不可缺少的一部分，被应用于从基础研究到疾病诊断、农业检测及法医调查等领域。其发明者Kally Mullis因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR可在短时间内将单个DNA扩增得到成千上万个拷贝。其过程主要由3步组成：（1）退火，双链DNA经加热变成单链DNA；（2）吸附，引物与模板的侧翼区结合；（3）延伸，DNA聚合酶沿着模板，将引物的3’端延伸。

PCR反应体系中的

6大关键组分

PCR的成功取决于很多因素，其反应组分在扩增中起着至关重要的作用。以下总结了在PCR反应体系设置中需要考虑的一些重要因素。

【模板DNA】

DNA扩增的模板可以是多种来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。DNA的组成和复杂程度决定了PCR扩增的最佳模板起始量。比如，在50μL体系中0.1-1 ng质粒DNA已经完全足够，但同样体系需要5-50 ng的gDNA。最佳模板起始量同时也取决于所用的DNA聚合酶类型，经过基因工程改造过的DNA聚合酶增强了与模板的亲和度，其灵敏度更高，因而所需的模板量少。过低的模板量会减少PCR的产量，过高的模板量可能造成非特异性扩增，所以DNA模板量的优化尤为重要。

除了gDNA、cDNA和质粒DNA，PCR产物也可作为模板以获得更高的产量。但PCR产物中存在的残余反应组分（如引物、dNTP、盐和副产物）可能会影响下一次的PCR反应。所以推荐在下一次PCR前使用PCR产物纯化试剂盒将PCR产物先进行纯化。

【DNA聚合酶】

DNA聚合酶是PCR扩增中最关键的组分。Taq DNA聚合酶是用于PCR扩增最广为人知的聚合酶，它的发现变革了PCR的应用。Taq DNA聚合酶有相对较高的热稳定性，在95 ℃有约40 min的半衰期。其合成速度约60 s/kb，可扩增约5 kb的片段。所以Taq酶适用于一般的常规PCR。如今，新一代的DNA聚合酶经研发可获得更好的PCR性能，如SuperFi DNA聚合酶、Phusion高保真DNA聚合酶等。

在50μL体系中，一般1-2 units的DNA聚合酶已经足够用于PCR扩增。但当扩增复杂模板时，需要适当调整所使用聚合酶的量。比如当抑制剂存在时，DNA聚合酶的增加会提高PCR产物的产量。但过多的DNA聚合酶会引起非特异性扩增。

【引物】

引物的设计应考虑以下因素：

【dNTP】

dNTP包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP，作为合成新DNA链的原料。通常情况下4种dNTP是等量加入反应体系中。只有当进行随机突变等特殊应用时，加入不同浓度的dNTP有助于突变的产生。一般情况下，PCR反应中每种dNTP的推荐浓度为0.2 nM。当Mg²⁺浓度过高时，因Mg²⁺可与dNTP结合，适当加入多量的dNTP有助于PCR反应的进行。但过多的dNTP也会抑制PCR反应。当使用非校正DNA聚合酶时，降低dNTP的浓度（0.01-0.05 nM）及Mg²⁺浓度有助于提高保真度。

【Mg²⁺】

Mg²⁺作为DNA聚合酶的辅助因子有助于dNTP的结合。在酶活性位点处的Mg²⁺催化引物3’羟基和dNTP磷酸基团间磷酸二酯键的形成，另外Mg²⁺可通过稳定磷酸基团上的负电荷以加速引物和DNA模板复合物的形成。

通常情况下Mg²⁺以MgCl₂形式提供，但对于一些诸如Pfu DNA聚合酶，Mg²⁺是以MgSO₄形式提供，硫酸根在一些情况下可增强扩增能力。通常Mg²⁺ 浓度在1-4 mM范围，低Mg²⁺ 浓度可导致无PCR产物或产物减少，高Mg²⁺ 浓度可导致非特异性PCR产物生成。