 什么是蛋白质转运？ 除了少量的蛋白质由线粒体和叶绿体 DNA 编码外，其余蛋白质都是由细胞核 DNA 编码，在细胞质游离/吸附的核糖体上合成。 细胞要发挥正常功能，必须使每一个蛋白质都要在膜（细胞膜，细胞器膜）或水相腔室（细胞质，细胞器基质或内膜腔）中正确定位。 如受体蛋白、离子通道蛋白和转运蛋白需要嵌在质膜内。DNA、RNA 聚合酶需要运送到核里。蛋白酶和过氧化氢酶应分别转运至溶酶体和过氧化物酶体。其他如细胞外间质和激素则需要分泌到细胞外。 也就是说蛋白质转运是 * 细胞内将新合成的蛋白分类，修饰并运输到正确目的地的过程。 * 可以将蛋白质转运形象化类比为街道上移动的交通工具：多方向运动，遵守交通规则，高度动态，每个都具有一个最终目的地。 * 蛋白质转运/蛋白质定位/蛋白质分发，这三个术语在文献中是可以互换的。 蛋白质转运主要有两条路径：内吞和外泌。 为什么要研究蛋白质的转运？ * 帮助我们了解细胞稳态的关键机制，蛋白质-蛋白质相互作用，翻译后修饰和细胞间的相互作用。 * 解释人类疾病发病机理，如亚细胞蛋白质转运发生错误，将会发生「转运异常疾病」，目前为止，已经发现超过 30 种转运异常疾病，囊性纤维病是最具代表性之一。这些疾病包括但不仅限于代谢、神经病变和癌症疾病。 如何研究蛋白质转运？ 研究方法主要有以下几类 * 放射自显影（脉冲追踪 + 电子显微镜） * 绿色荧光蛋白（GFP）+ 显微镜检查 * 突变体 + 绿色荧光蛋白（GFP） * 生化分析和无细胞系统 * 亚细胞结构分离 + Western，IP，交联质谱技术（XL-MS） 其中亚细胞结构分离 + Western，IP，交联质谱技术（XL-MS）是目前最常用的方法。 亚细胞结构分离方法研究蛋白转运应用举例 Example A. ULBP2 Trafficking Blockage Leung 等人[1]研究 PRL-3 对 ULBP2 蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系 HCT116 使用 40uM PRL-3 处理，然后使用离心管柱法进行亚细胞结构分离。 结果显示，细胞质膜，细胞器和细胞浆组分被彻底分离，经过化学处理后的细胞导致 ULBP2 从细胞膜迁移到细胞器组分，而各组分中其他蛋白质在 PRL-3 处理前后无明显变化。 Example B. HIV Gag Protein Trafficking Kutluay 等人[2]研究 HIV-1 病毒颗粒组装过程中 Gag-RNA 复合体的分布及变化情况。实验中关键步骤之一是证明在不同亚细胞结构中 Gag-RNA 复合体表现出不同形式。 用 HIV-1 病毒质粒转染 4SU-fed 293T 细胞后，通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后的细胞浆和细胞膜组分进行 Western 印迹和免疫沉淀实验。 结果表明，胞浆中的 Gag 蛋白主要是单体形式，而细胞质膜上的 Gag 蛋白是多聚体形式（图 B）。这一结论很大程度上取决于细胞浆和细胞质膜组分的彻底分离（图 A）。 Example C. Isolated Plasma Membrane Shows Clearer Signals Kashiwagi Y. et al. PLOS one （2015） , Spin Column-Based Fractionation. 大部分质膜蛋白为低丰度表达，没有经过分离和富集时很难检测和定量。上图数据[3]显示质膜蛋白富集后对灌注后小鼠心脏样品中 SGLT1 检测效果的影响。与总膜部分相比，SGLT1 和质膜蛋白内参 Na+/K+ ATPase 信号在质膜蛋白组分中都有显着的增强。 Example D. Distribution of Target Proteins Georgiou 等人[4]研究钙离子通道复合物 Cav1.1 调控脂肪酸转运蛋白 CD36 分布和脂肪酸代谢。Cav1.1 E1014K 基因敲除小鼠（EK）和野生小鼠（WT）的肌肉组织样品，通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后的细胞浆，细胞核，细胞膜以及纯化的线粒体组分进行 Western 印迹检测 CD36 的表达及分布情况。 Lamin A，GAPDH 及 VDAC 分别为细胞核，细胞浆及线粒体组分的内参。结果表明，与 WT 相比，EK 小鼠的 CD36 在细胞浆组分中增加，在质膜组分中减少。其它膜蛋白（eNOS,Cav1.1,RyR1）则无明显变化。 Example E. Cell Fractionation and IP Devarakonda 等人[5]研究乳腺癌患者细胞 HSP90 蛋白与重链抗体（HCAb1 及 HCAb2）靶向结合。乳腺癌样品通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后用细胞浆和细胞膜蛋白进行 IP 实验。 结果表明只有 HCAb2 可在细胞浆中沉淀内源 HSP90 及重组蛋白（HSP90beta），HCAb2 也可在细胞质膜中沉淀内源 HSP90。 亚细胞结构分离的常用方法有哪些？ 1. 蔗糖密度超高速离心分离法 传统方法进行亚细胞结构分离是通过蔗糖密度超高速离心分离[6,7]，操作方法十分繁琐和耗时并且需要较大样品量。 通常需要几个小时甚至几天才能完成。步骤复杂，需要特殊设备仪器，自配溶液，以及需要优良的操作技术。 2. 表面活性剂提取法 大部分商业试剂盒属于这类方法。可将细胞分为两大组分：胞浆蛋白和总膜蛋白，但无法单独提取质膜蛋白组分，下游无法进行蛋白互作类研究。 3. 离心管柱法亚细胞结构分离法 你可能不知道，离心管柱法是新一代的亚细胞结构分离技术。离心管柱法亚细胞结构分离无需匀浆仪和超高速离心机，简单而快速。 细胞/组织样品首先通过一个特制的离心管柱，在这个过程中细胞膜会被破裂，完整的细胞核，细胞器，质膜和胞浆蛋白被释放到溶液中，之后进一步分离成五个组分：细胞核，细胞浆，总膜，细胞器，质膜。 使用离心管柱和独特的缓冲系统配合，可以获得高回收率，低交叉污染的天然亚细胞结构蛋白，整个操作不到一小时即可完成。 文章来源：英文特 |
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