Plant Cell | 解析拟南芥蛋白质K63多泛素化修饰网络

真核生物中，蛋白质的翻译后修饰对于蛋白质的功能具有重要调控作用。在各种蛋白质翻译后修饰中，研究最多且过程最为复杂的是蛋白质泛素化修饰。泛素（ubiquitin，Ub）是一种具有76个氨基酸的多肽，可以在泛素激活酶（Ub-activating enzymes E1）、泛素结合酶（Ub-conjugating enzymes E2）以及泛素连接酶（Ub ligases E3）的依次催化下与底物蛋白或者泛素分子共价结合【1】。E1消耗ATP激活泛素分子通过硫酯键形成E1~Ub；E2通过半胱氨酸残基接收活化的泛素，形成E2~Ub；E3可以连接E2~Ub和底物蛋白，催化泛素C端甘氨酸残基与底物蛋白上赖氨酸（lysine，K）残基上的ε-氨基形成异肽键（isopeptide bond）共价结合【2】。下一个泛素分子继续通过C端甘氨酸残基与上一个泛素的赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48 或K63）或者N端的蛋氨酸连接【3】。根据所添加泛素分子数目的不同，泛素化修饰分为单泛素化修饰和多泛素化修饰；多泛素化修饰又可根据所连接的赖氨酸位置不同分为K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63等类型。单泛素化影响蛋白质的定位及相互作用；多泛素化中以K48类型最多，K63次之，K11类型的再次，K48和K11类型的多泛素化修饰介导蛋白质通过26S蛋白酶体降解【2】；酵母和动物中的研究表明K63类型的多泛素化修饰通常不会导致蛋白质依赖于蛋白酶体的降解，而是导致膜蛋白的内吞，DNA损伤响应，细胞自噬，信号传导等过程【4】。植物中关于K63类型多泛素化修饰的报道较少，对于植物K63类型多泛素化发生机制以及对于生长发育的影响还知之不多。

近日，法国巴黎-萨克雷大学（Université Paris-Saclay）的Grégory Vert教授团队利用转录组，蛋白互作组及蛋白质组等方法，解析了拟南芥K63类型多泛素化修饰的调控网络，探索了K63类型多泛素化修饰对植物生长发育的重要调控功能。相关结果以Advanced Cataloging of Lysine-63 Polyubiquitin Networks by Genomic, Interactome, and Sensor-based Proteomic Analyses为题发表在The Plant Cell 上。

在动物中K63多泛素化修饰依赖于E2 UBC13【5】，研究者将拟南芥UBC13的两个同源基因UBC35和UBC36同时突变后，K63多泛素化修饰消失，植株发育受到显著影响，大部分ubc35-1 ubc36-2双突只活到子叶阶段，少量生长到生殖生长阶段表型严重育性降低。利用转录组分析发现在UBC35/36敲低的植物中与生物及非生物胁迫相关的基因显著上调而与芥子油苷代谢，细胞周期，微管运动及RNA加工相关的基因显著下调。

图1：UBC35和UBC36催化蛋白质的K63多泛素修饰并影响拟南芥生长发育

为了寻找参与K63 多泛素修饰的E3，研究者以UBC35、UBC36及四个辅因子UEV1A-D为诱饵，利用酵母双杂交进行互作蛋白筛选。共鉴定到24个互作蛋白，其中13个E3，大部分属于RING/U-box家族，暗示这些E3与UBC35/36构成E2-E3组合参与催化底物蛋白的K63多泛素修饰。

研究者进一步构建了含有可识别K63多泛素修饰的sensor （Vx3K0-NLS-mCit）的转基因材料。Vx3K0-NLS-mCit可以特异的结合K63多泛素，并利用GFP融合蛋白进行定位追踪和免疫沉淀。研究者对转基因植株进行蛋白提取，免疫沉淀，胃蛋白酶消化及质谱分析后鉴定到约400个含有K63多泛素修饰的蛋白。GO分析表明这些蛋白参与到代谢、微管运输、跨膜转运、细胞核转运蛋白、染色体结构及RNA剪切等过程。为了进一步验证Vx3K0-NLS-mCit sensor的可靠性，研究者将部分该方法鉴定到的底物蛋白接上GFP标签稳定转化到拟南芥或瞬时表达于烟草叶肉细胞。然后利用GFP抗体进行免疫沉淀，并用K63多泛素特异抗体进行Western Blot检测，的确检测到在这些蛋白上存在K63多泛素修饰。

图2：蛋白质K63多泛素化影响的生理过程

综上所述，该研究利用转录组，蛋白互作组，蛋白质组等技术，确认拟南芥K63多泛素修饰依赖于E2 UBC35/36，鉴定到13个潜在的参与K63多泛素修饰的E3及近400个含有K63多泛素修饰的底物蛋白，构建了拟南芥K63多泛素修饰的网络。同时，该研究揭示了K63多泛素修饰通过调控生物及非生物胁迫响应、物质代谢、微管运输、跨膜转运、细胞核转运蛋白、染色体结构、RNA剪切等过程影响拟南芥的生长发育。

参考文献：

[1] Mukhopadhyay, D., and Riezman, H. (2007). Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling. Science 315, 201-205.

[2] Pickart, C.M., and Fushman, D. (2004). Polyubiquitin chains: polymeric protein signals. Curr Opin Chem Biol 8, 610-616.

[3] Kirisako, T., Kamei, K., Murata, S., Kato, M., Fukumoto, H., Kanie, M., Sano, S.,Tokunaga, F., Tanaka, K., and Iwai, K. (2006). A ubiquitin ligase complex assembles linear polyubiquitin chains. EMBO J 25, 4877-4887.

[4] Komander, D., and Rape, M. (2012). The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry,Vol 81, 203-229.

[5] Hodge, C.D., Spyracopoulos, L., and Glover, J.N. (2016). Ubc13: the Lys63 ubiquitin chain building machine. Oncotarget 7, 64471-64504.

论文链接：

http://www./content/early/2019/11/11/tpc.19.00568