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作者：米粒儿 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 肝癌是全球第三位癌症杀手，其治疗方法以手术治疗为最佳。但是即使早起切除，5年内复发转移的比例仍超过50%。因此从根本上揭示肝癌转移复发的机理对肝癌治疗是十分重要的。 上皮-间质转化（EMT）是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的最重要途径，而转化因子TGF-β是已知诱导肿瘤细胞发生EMT的关键因子。通过TGF-β诱导EMT是研究癌细胞转移的重要手段，也是多数论文的主要选择之一。 今天跟大家分享一篇论文，以miRNA主要研究对象，探讨miRNA如何影响TGF-β诱导的EMT的效应。 题目：MicroRNA-199b-5p attenuates TGF-β1-induced epithelial–mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma （回复20170622可下载文献） 这篇文章以N-cadherin为起始研究分子，探讨N-cadherin的临床意义，分别在病人癌、癌旁组织，HCC细胞系检测N-cadherin表达，并以DFS和OS为评价指标，确定N-cadherin表达与预后关系。之后，作者通过数据库筛选和实验验证方找寻到与N-cadherin表达相关的miRNA-miR-199b-5p。 同时通过临床数据揭示miR-199b-5p具有明显的临床意义，且在HCC组织样本中miR-199b-5p和N-cadherin表达呈现明显的负相关性。接下来，文章以miR-199b-5p为核心分子，分别从表型，机制和动物实验3方面揭示在HCC细胞和癌组织中，miR-199b-5p抑制TGF-β诱导的EMT的效应。 下边为大家仔细批讲这篇论文的主要数据。 1.N-cadherin在HCC组织中高表达且和不良预后相关 采用免疫组化方法检测了100个HCC病人癌、癌旁组织中N-cadherin的表达。结果如Figure 1A，1B所示，癌组织中N-cadherin表达量明显升高。 采用Western blot方法在系列HCC细胞系中检测N-cadherin的表达（Figure 1C），与正常肝细胞系HL7702相比，HCC细胞系中N-cadherin的表达升高。 进一步研究N-cadherin表达与HCC病人预后的关系（Figure 1D），发现N-cadherin高表达的HCC病人无病生存期DFS和总体生存率OS都较短。 此外，还研究了N-cadherin表达与HCC病人临床病理特征的关系，N-cadherin过表达与肿瘤分化程度，肿瘤多灶性和血管侵袭能力呈现明显相关性。 2.在HCC细胞中，N-cadherin是miR-199b-5p的靶标 为了探讨miRNAs是否参与N-cadherin表达调节，作者通过数据库筛选出8个可能靶向N-cadherin的miRNA，分别是hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-199-5p, hsa-miR-190, has-miR-204, hsa-miR-211, hsa-miR-218 and hsa-miR-369-3p（Figure 2A）。 将以上8个miRNA mimics转染进入HepG2细胞，作者采用Western blot检测N-cadherin表达，结果显示与其他7个相比，miR-199b-5p mimics转染后，N-cadherin表达量下降最多（Figure 2B）。 miR-199b-5p和N-cadherin 3’-UTR 的碱基配对如图Figure 2C所示。为了进一步确定miR-199b-5p是否可调节N-cadherin表达，在HepG2和Huh7细胞中分别加入不同浓度的miR-199b-5p mimics和inhibitor后，检测N-cadherin表达。 在miR-199b-5p高表达的HepG2中，N-cadherin的蛋白和mRNA表达水平降低，而在miR-199b-5p表达较低的Huh7细胞中，N-cadherin的蛋白和mRNA表达水平升高（Figure 2D）。 而在HepG2中加入miR-199b-5p inhibitor或者Huh7细胞中加入miR-199b-5p后，N-cadherin的蛋白和mRNA表达水平与上述结果相反（Figure 2E）。 3.miR-199b-5p在HCC组织和细胞系中低表达 分析100个病人癌和癌旁组织中，miR-199b-5p在大部分HCC组织中表达降低。并且miR-199b-5p和N-cadherin的表达呈现明显的负相关（Figure 3A，3B）。 进一步研究miR-199b-5p表达与HCC病人预后的关系（Figure 1D），发现miR-199b-5p低表达的HCC病人无病生存期DFS和总体生存率OS都较短（Figure 3C，3D）。 在HCC细胞系中，miR-199b-5p表达降低，且其表达和N-cadherin表达负相关（Figure 3E，3F）。 4.miR-199b-5p过表达促进细胞凝集，抑制细胞侵袭转移，N-cadherin表达能逆转该效应 在确定miR-199b-5p和N-cadherin的相互作用之后，作者开启表型实验研究，这里供选择3个表型：细胞凝集，细胞侵袭和细胞转移。 在miR-199b-5p过表达的细胞株中，细胞凝聚效应增强，细胞侵袭转移能力下降（Figure 4C，D，E，F）。而N-cadherin表达可以部分逆转以上表型（Figure 4I-L）。 5.miR-199b-5p缓解TGF-β1引起的EMT 在表型实验中作者发现miR-199b-5p可抑制细胞侵袭转移能力，而EMT是侵袭转移能力的重要指标之一。接下来的实验中作者在HCC细胞中加入TGF-β1诱导细胞EMT。之后分别分析，miR-199b-5p和N-cadherin对TGF-β1引起的EMT的影响。结果表明miR-199b-5p过表达可缓解TGF-β1引起的EMT。同样的结果在体内实验中也得到了验证。 参考文献：MicroRNA-199b-5p attenuates TGF-β1-induced epithelial–mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma |
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