【GenePilot】脑脊液ctDNA检测——打破中枢神经系统肿瘤精准诊疗困境

springer009 2017-07-01

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导读

近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率以1%~2%的增长率逐年递增，在中国，发病率达到2~5/10万，其致死率过半。以影像学为主的常规临床检测方式，其滞后性与非特异性已无法满足现代精准医疗的要求。为突破困境，脑脊液作为中枢神经系统中的循环液体，研究表明含有可检测的循环肿瘤DNA，因此检测脑脊液中ctDNA的变化可反映实体瘤的情况。通过腰椎穿刺获取患者样品后，可对其进行分型、药物匹配、预后及疾病的动态进展的评估，为脑肿瘤患者的精准诊疗带来新希望。

影像学检测技术的局限性

许多不同亚型的原发病人接受外科手术伴随放疗和化疗，由于缺乏中枢神经系统恶性肿瘤临床生物标志物，对病人的常规监控方式是通过计算机断层扫描射线照射或者MRI(Magnetic Resonance Imaging)^[1]。然而，影像学在疾病的进展过程中对组织改变的检测，通常是非特异性、滞后的（明显肿瘤团块形成时才有效）。传统诊疗过程中，为了监测疾病进展，病人就必然需要接受额外的外科手术或射线。

因此，临床急需一个敏感性、特异性较高的肿瘤标志物。

微创技术与液体活检

微创技术检测疾病负担，对许多中枢神经系统疾病来说是一种挑战，这种挑战与外科手术的高风险和现代成像模式的局限性相关。由于目前还缺乏一种有效的方式来评估肿瘤复发的风险或疗效，因此许多病人需要接受重复的外科手术，例如30%的胶质母细胞瘤患者需要在复发时接受重复的外科手术。手术带来一定损伤的同时，化疗和放疗也将被暂停，这就耽误了对病情有效的新治疗靶点被检测的机会。

近年来，从肿瘤细胞释放的cfDNA被证实可作为肿瘤特异性的生物标志物。ctDNA可以在多数的恶性肿瘤的血浆中检测到。然而，在脑肿瘤中，包括高级别胶质瘤和髓母细胞瘤，可能由于血-脑屏障的存在而很难检测到ctDNA。

图1. 血—脑屏障模式图

如何突破脑肿瘤中检测ctDNA的瓶颈？

脑脊液特征

脑脊液（Cerebro-Spinal Fluid, CSF），无色透明液体，充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内，由脑室中的脉络丛产生。正常成人的脑脊液约100-150ml，处于不断产生、循环和回流的平衡状态，与中枢神经系统肿瘤细胞有密切接触，因此，中枢神经系统疾病中，常常通过腰椎穿刺吸取脑脊液检查协助诊断。目前对于脑部肿瘤的检测微创技术有：核磁共振成像和脑脊液的细胞学检查，这两种方法都不能提供肿瘤组织基因组水平变化的信息。基于脑脊液与肿瘤组织、细胞有大范围的直接接触，脑脊液很显然可作为脑癌液体活检样本的潜在来源，从而对脑部肿瘤的原发灶及转移灶进行基因组水平的分析。

脑脊液中检测ctDNA

一些研究证实：ctDNA可以在解剖学相关的液体中发现，例如膀胱癌检测尿液、肺癌病人检测胸水。基于以上证据，研究人员考虑到原发性中枢神经系统肿瘤是否可以在脑脊液中检测到一定水平的ctDNA？

图2. 恶性脑肿瘤患者ctDNA释放到脑脊液中模拟图

证实一：脑脊液含有可检测的ctDNA

为证实猜想， Pan W等进行的一项研究表明：ctDNA可以在个体（原发性肿瘤脑转移）的脑脊液中检测到^[2]。腰椎穿刺获取脑脊液作为一种微创方式，在脑肿瘤病人的样本获取中是常规可行的。

图3. 腰椎穿刺获取CSF及其检测

研究显示：CSF样品中，74%（26/35）可检测到ctDNA^[3]，与其他类型肿瘤中液体活检的检出率相近^[4]。尽管本研究的检出率未达到100%，但是与其他的恶性肿瘤常规非创伤性实验相比仍是较优的。

脑脊液可以在脑室和脊髓腔中快速循环^[5]。因此，从脊髓腔通过腰椎穿刺获得的DNA与开颅手术中获取的样品非常相近。但需要注意的是，个体中大的组织块会阻断脑脊液或增加颅内压，腰穿可能存在风险。因此腰椎穿刺需要个性化对待，参考因素有肿瘤位置、CSF样品获取难易度以及患者临床特点等。

对于手术或活检不能实现时，利用腰椎穿刺获取CSF，对ctDNA进行相关基因的变异情况检测，可为肿瘤的分型、预后以及药物匹配等提供重要的诊疗依据。

证实二：CSF-ctDNA监控肿瘤变化

原发性中枢神经系统肿瘤、脑转移瘤经过检测，发现脑脊液中ctDNA的含量远高于血浆。液体活检相对于组织活检而言，其对肿瘤的复发监测方面有更显著的优势：方便，决定其可应用于肿瘤病人的病情随访，多次取样。那么，脑脊液中ctDNA的丰度是否存在动态变化规律？

2015年，西班牙Vall d’Hebron大学的研究人员也进行了相应探索。

检测方案：通过开颅手术获取脑脊液样品，鉴定CSF-ctDNA的基础水平，腰穿样品可以作为纵向研究，检测其随时间的推移，检出水平的变化。结果发现，CSF-ctDNA随着时间推移与肿瘤负荷（TMB）的变化，存在丰度的改变^[6]。

脑瘤的复发监控：胶质母细胞瘤（GBM）经手术完全清理病灶后，仍会高度复发。复发的GBM基因组会发生明显变异，CSF-ctDNA将以最小风险对复发情况进行评估，从而通过分子特征变化协助制定诊疗方案。

颅内转移瘤：由于脑的特殊环境，颅内转移瘤基因组的改变不同于原发性肿瘤，预后不良。通过CSF-ctDNA来检测基因组的变异，可以增加对原发组织病理和转移灶病理变化情况的全面认识，协助推动精准诊疗在脑转移瘤上的应用。

随着脑肿瘤的病理变化，CSF-ctDNA能为脑肿瘤监控提供有效的生物标记，其动态变化可直接反应诊疗效果。

泛生子基因检测示例

基于对脑脊液ctDNA检测作为脑肿瘤的液体活检形式，尤其结合二代测序（NGS）平台优势，泛生子基因于2015年就开始进行脑脊液临床检测应用领域的探索，至今已积累近百例脑脊液检测的实战经验与数据，如下案例：

图4. 高灵敏度数字PCR平台检测胶质瘤脑脊液

注：GBM：glioblastoma，BSG：glioma of brain stem；

黄色标注为肿瘤位置，√：检测到对应突变；※：未检测到对应突变。

高灵敏度数字PCR检测平台：在对GBM和BSG两种胶质瘤患者的肿瘤组织、CSF、血浆三种不同样品的检测结果中显示，CSF中ctDNA与肿瘤组织的gDNA的突变位点的检测一致性非常高；同时，在相同病人的血浆ctDNA中却检测不到对应变异信息。

参考文献：

[1] Kros JM, et al. (2014) Circulating glioma biomarkers. Neuro-oncol, 10.1093/neuonc/nou207.

[2] Pan W, Gu W, Nagpal S, Gephart MH, Quake SR (2015) Brain tumor mutations detected in cerebral spinal fluid. Clin Chem 61(3):514–522.

[3] Yuxuan W，et al.(2015) Detection of tumor-derived DNA in cerebrospinal fluid of patients with primary tumors of the brain and spinal cord. PNAS 112(31):9704-9.

[4] Allory Y, et al. (2014) Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in bladder cancer: High frequency across stages, detection in urine, and lack of association with outcome. Eur Urol 65(2):360–366.

[5] Chamberlain MC, Kormanik PA, Glantz MJ (2001) A comparison between ventricular and lumbar cerebrospinal fluid cytology in adult patients with leptomeningeal metastases. Neuro-oncol 3(1):42–45.

[6] LD Mattos-Arruda, et al. (2015) Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature Communications 6: 8839.

本章内容小结

结合理论与实际，大多原发性脑肿瘤可以释放ctDNA到CSF中，通过腰椎穿刺这种微创形式，可常规获取脑脊液中的ctDNA作为临床研究的生物标志物。因此，CSF-ctDNA为复发、不宜进行手术的患者提供了新的选择，可用于辅助制定后续治疗方案，更打破了精准医疗时代下中枢神经系统肿瘤诊疗的困境，为患者带来了新的希望。

下期预告

脑脊液ctDNA液体活检应用系列之——经典案例