拨云见日——揭开第三代测序技术的神秘面纱

哈喽，各位看官，对于基因测序相信大家已经有所接触。从1977年第一代DNA 测序技术（Sanger 双脱氧链终止法）开始，人们迈出对基因结构探索的脚步。到2001年，完成首个人类基因组图谱，人类开始真正认识自我。为了降低测序费用、增加测序通量、提高测序速度，第二代测序随之产生，但是短读长是它的先天缺陷，无法跨越高重复区域、高复杂程度的基因。人们为了追求更长读长，脚步没有一刻的歇息，第三代测序技术应运而生，接下来小编将会为您拨开第三代测序的神秘面纱，看清第三代测序的真相。

原理介绍

第三代测序技术是指单分子测序技术，对于DNA 样本不需要经过PCR 扩增，实现了对每一条DNA 分子的单独测序。基本原理：当DNA 模板被聚合酶捕获后，4 种不同荧光标记的dNTP 通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间。因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4 种荧光信号与时间的关系，即可测定DNA 模板序列。

图1 测序原理示意图

关键技术

ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）：就像微波炉壁上可看到有很多密集的小孔，小孔直径很有考究，如果直径大于微波波长，能量就会穿透面板泄露。如果孔径小于波长，能量不会辐射外部，可起保护作用。同理，在一个反应管中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20X 10-21 L），正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外游离的核苷酸单体依然留在黑暗中，将背景降到最低。

图2 ZMW示意图

荧光标记的脱氧核苷酸 ：将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上，当核苷酸掺入到新生的链中，标记基团就会自动脱落，减少了DNA 合成的空间位阻，维持DNA 链连续合成，延长了测序读长。

图3 荧光标记的脱氧核苷酸示意图

优势

超长读长：PacBio Sequel平台最大读长能达到70kb，平均读长12~15kb，能够完美跨越高重复区域和高复杂区域，减少拼接成本。

无GC偏好性：对于DNA 样本，无需PCR 扩增，避免了覆盖度不均一和PCR 冗余，完全跨过高GC 含量区域，保证序列的均匀覆盖度。

直接检测碱基修饰：根据不同类型的修饰碱基具有不同的DNA 聚合酶动力学特征，直接判断碱基的甲基化类型。

较短的运行时间：每个SMRT Cell 运行时间可选择30分钟到6小时之间，运行时间灵活。

应用方向

全长转录组：借助其超长读长，无需拼接，直接获得包含5’，3’ 末端，poly A tail 的完整转录本，从而准确辨别二代测序无法识别的同源异构体，同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本，同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息。

全基因组测序：由于具有读长长的特点，在基因组测序中能降低测序后的Contig 数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。

目标区域测序：目标区域测序能够提高变异发现率和降低检测成本，可以应用到人类疾病、植物、动物、微生物和传染病遗传变异的研究，能够得到相关目标区域的完整结构。

甲基化研究：第三代测序采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测，聚合酶合成每一个碱基，都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，当相邻两个碱基的脉冲峰之间的距离和参考序列之间的距离的比值大于1时，就可以推断这个位置有修饰。

突变鉴定（SNP检测）：第三代测序无需PCR 扩增，没有扩增引入的碱基错误，具有不可比拟的分辨率优势，对于混合群体中低至 1/100的稀有突变都可以检出。

宏基因组测序：利用超长读长能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等环境中微生物的种类，能够更加快捷地获得更多微生物物种的全基因组序列。

全长扩增子：16S rDNA 长度大约为1540bp，利用第三代测序超长读长优势可以成功获得16S的全长序列。

通过小编以上的介绍，相信大家已经对三代测序有了一些了解，目前南京扬子国资投资集团投资购买并委托南京诺禾致源生物科技有限公司运行的PacBio Sequel 测序平台已经稳定运转，可为老师提供通量更高、周期更短、信息分析更全面的第三代测序服务。

诺禾致源：

诺禾致源创立于2011年3月，公司总部位于北京，在天津，南京，美国和新加坡设有实验基地，并在香港、美国、英国和新加坡设有分公司。目前已建成亚太地区通量规模最大的基因测序中心，每年可完成 40000 人全基因组测序的超高通量。诺禾以深度基因测序和大数据分析为核心技术，持续研发国际领先的肿瘤管理产品，提供贯穿肿瘤预测、预防、诊断、治疗、复发监测等全过程的肿瘤精准诊疗解决方案。

本文由诺禾致源原创，转载必须注明转自诺禾致源！