|
Western Blot 是最常用的蛋白验证技术，但是该技术的Troubleshooting却非常依赖经验的积累。 （为了效率起见，接下来我们把它亲切地缩略为WB） 小编第一次接触WB时是大四的Immunology实验课，如今回想起来可谓兴奋中带着凌乱。 即使每一步骤都紧随Protocol，最终拿到的也只是一条水墨画而已。 最近去扒各个科研小伙伴们聚集的论坛，针对WB的Troubleshooting说成哀嚎遍野毫不为过。 今天，小编就来为各位呕血整理一下WB中常遇的坑，以及相应的解决方案~ 1 高背景 高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方有弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。 新手翻车指数：???????? 原因：封闭不够好，一抗或二抗浓度高，洗膜时间和次数不够。 解决办法： 1. 增加封闭液中的蛋白浓度，例如使用3-5%浓度的BSA、酪蛋白或脱脂奶粉。 2. 降低一抗/二抗浓度，增加洗膜时间和次数。 经验：高背景的问题只要注意操作规范，不偷工减料就很容易避免。洗膜按照规定来，5min 重复5次或者10min 重复3次。也可以在洗膜液中加入0.1%的Tween-20，提高洗膜效果。 2 非特异性条带 此种情况绝大多数是因为一抗不好，导致无法判断哪一条是目的条带。 新手翻车指数：?????? 原因：一抗非特异性与蛋白结合。 解决办法：更换一抗。 经验：如果实在没有更好的抗体就只能原地委屈吗？ 不，见过世面的大神建议走投无路之时，也可以采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。 当然，任性如你也可以换更好用的一抗，比如说本命家出的开头为MA的系列一抗，也是你WB生涯必不可少的挽尊神器。 3 没有任何条带… ( 此处省略N幅图...... ) 新手翻车指数：???? 原因：拿白卷的原因比较多，如果单纯一张没有任何显色的CCD照片/X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的（不要笑，我不信只有我一个人犯过这种伟大的错误。） 解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。 经验：如果图片展示的是一点信号都没有，大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL底物灵敏度不高。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片（嘿嘿嘿）。 4 条带中出现边缘规则的白圈 多由于转膜过程中操作手法不够娴熟造成。 新手翻车指数：???????? 原因：电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡。 经验：将电转液倒入时，液体最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下。将电泳胶平铺到滤纸上后，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液。用两只手的拇指和食指轻轻捏住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒或者专用工具赶气泡。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。总而言之，这是同时考验眼鼻口舌身意的一道工序。转膜之前一定要摒除杂念，怀着虔诚之心下手，待PVDF如蝉翼，方得始终。 5 出现黑点和黑斑 由于封闭牛奶中有不溶性颗粒附着在膜上造成。
原因：1. 膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合； 2. 膜上有碎胶。 解决办法： 1. 封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗； 2. 转印后，充分清洗印记膜，以除去膜上的碎胶。 经验：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。 6 条带拖尾(俗称扫把星) 一般由于一抗浓度太高或作用时间太长造成。 新手翻车指数：???? 原因：蛋白量太大，一抗浓度高，孵育时间长。 解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减料，建议5min X 5次（敲黑板，这是老手的常见坑），不要担心洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。 |
|
|
来自： stingray928 > 《待分类1》
