【文献学习】肠道微生物如何抑制蛋白酶？【创新点、创新方法、学术写作解读】

微笑如酒 2017-07-19

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生物极客导读：

小伙伴们大家好，今天我们生物极客公众号，将开启一个新的篇章，将非常详细的以文献Journal Club的方式，从文献背景、研究创新手段、研究方法等多种手段极为细致的对文章进行分析。

今天我们选择的文章是来自UCSF的Michael A. Fischbach 课题组16年在Cell发表的文章：“Discoveryof Reactive Microbiota-Derived Metabolites that Inhibit Host Proteases”通过对肠道微生物大规模菌群的分析，从而鉴定出来活性的基因座，可以产生活性分子，抑制蛋白酶活性。

这项工作，以多学科交叉的思路，从生物信息的基因组挖掘，到质谱化学生物学，然后蛋白组学等多种手段，揭开了肠道微生物菌群对宿主影响，尤其是肠道菌群分泌小分子的鉴定，具有非常深远的影响，有鉴于此，我们将从多个方面进行深入的学习。

文献背景：

人们已经知道，肠道菌群对于人体有多许许多多的影响，然而在分子水平解析肠道菌群对人体宿主的影响还知之甚少，在课题组前期的工作中，他们发现肠道菌群中存在数千个基因座，这些基因座在NIH人类肠道菌群宏基因组计划的大于50%样本中都有出现，那么这些基因座产生的小分子，究竟有会什么样的活性，为什么他们的基因会如此丰富的出现在肠道菌群？

为了探索这个问题，科学家们选择非核糖体多肽合成酶基因座进行分析【nonribosomal peptide synthetase (NRPS) gene clusters】，非核糖体多肽合成酶基因座产生非常多的明星分子，比如我们常见的抗生素。科学家们发现这个基因座在多达90%的粪便样本的宏基因组测序中都可以发现，而且在其他样本中发现很少，说明与肠道微生物的活性息息相关。

那么这个基因座家族究竟扮演什么样的角色？该使用什么方法探究这个问题？发现相应的结果？

科学发现脉络：

生物信息基因座挖掘

为了研究这个基因座的生物功能，首先需要做的便是系统性看一看在不同的宏基因组测序样品中，这个基因座家族究竟有着怎么样的特征？有哪些酶，有哪些辅助的蛋白？

科学家们采取了叫做“multi-gene BLAST search ”的方法鉴定了总共47种这个家族的基因座如下图：

在这47个基因座中，大部分是来自于anaerobic Firmicutes ,theclass Clostridia 菌中，那么如何研究这些基因座的功能那？

体外重构反应途径

科学家们首先想到的便是直接合成这些片段，由于clostridia菌非常难于遗传操作，因此科学家们在Ecoli和Bacillus subtilis 菌中，植入这些片段，看看当这些片段植入后，能不能得到一些新的小分子？

因此科学家们选择了14个基因座进行合成，然后对细菌进行液相色谱质谱连用仪探究新的化合物。

液相色谱质谱联用

科学家们发现，对于含有bgc35和bgc52的基因的大肠杆菌，还真的可以发现多个新的峰图：

通过NMR等多种方法，科学家们发现这些分子大多是pyrazinones 和 dihydropyrazinones如下图：

不过问题也来了，究竟这些新的分子是不是在原始的肠道菌群存在？

这需要从两方面来回答，首先，是否这些基因在原始的细菌中能合成这些产物？第二，这些基因是否在原始的细菌中表达？

第一个问题，是否是这些基因合成的这些产物？怎么来回答这个问题那？最好的方法就是体外实现，通过添加原料，然后在体外纯化的酶的促进下，可以合成相应的分子，另外验证是否原始的菌产生这个产物。

的确如此，那么这些基因是否表达那？

通过RNA-seq便可以发现，科学家们发现这些基因位点的RNA-seq reads覆盖度很高：

说明这些基因有明显的表达。

那么这些产生的产物究竟有什么活性？

考虑到结构的相似性，很有可能这些小分子参与的是蛋白酶活性抑制剂。为了验证这个猜想，科学家们首先将小分子和一些已经报道的蛋白酶相互作用，发现在nM级别就非常明显的抑制，除此之外，为了更加精细的探究蛋白酶活性在全局的作用，科学家们使用了蛋白组学，探究小分子在细胞内的靶标。

文献创新点：

基于生物信息的基因组挖掘，这项技术，极大的扩宽了人们的视野，可以从更丰富的角度考虑问题。
综合使用多种技术和手段，可以看到在这篇文章中，质谱、蛋白组学等多种手段为科学问题的发现奠定了基础。

写作学习积累：

词组积累

influence host biology in numerous ways,
at the level of molecular mechanism
the presence of thousands of biosyntheticloci of unknown function
are capable of producing
The small-molecule products of these genetic elements represent large gaps in ourknowledge of
we set out tocharacterize
These clusters attractedour attention for two rea- sons.
suggesting that the metabolites they encode are widely distributed among healthy hu- mans.
raising the possibility that their small-mole- culeproducts play a role in interspecies signaling in the gut.
they residealmost exclusively in gut bacterial genome sequences; only a few environmentalisolates harbor acluster in the family,
We began by performing a multi-gene BLAST search (Medema et al., 2013) to identifynew clusters in the family from genome se quences that had beendeposited since our previous analysis.
This search yielded 19 new clusters at a threshold of 30%average sequence identity, increasingthe size of the family to 47
It consists offour clades: one featuresa three-module NRPS (e.g., bgc52), another a two-module NRPS and a loading module on aseparate protein
As such, the only way to access these clusters is to synthesizethem,
Since none of the host organisms have been manipulatedgenetically and most are from a bacterial class (Clostridia) that is largely refractory togenetic manipulation, we decided not to make targeted genetic deletions in anyof the native host strains. Instead,
Having identified the small-molecule products of a subsetof the gut NRPS family, we nextturned to the question of how widely distributed this cluster family isin the human population.
These data werederived from a global analysis that involved mapping metagenomic reads to proteinsfrom 14,000 biosyn- thetic gene clusters (BGCs) using the fast, metagenomics-opti- mized algorithmmBLASTx
Here, we usedtwo complementary methods to determinethe abundance of the gut NRPS family in publicly available metagenomicdatasets.
we developed ahighly sensitive and specific analytical method in
we used arecently developed approachthat leverages a large gene catalog of >9 million gut microbiome genes
Together, these results confirmthat this gene cluster family is widely distributed in healthy human subjects.

文献信息：

摘要：

The gut microbiota modulatehost biology in numerous ways, but little is known about the molec- ularmediators of these interactions. Previously, we found a widely distributedfamily of nonribosomal peptide synthetase gene clusters in gut bacteria. Here,by expressing a subset of these clusters in Escherichia coli or Bacillussubtilis, we show that they encode pyrazinones and dihydropyrazinones. At leastone of the 47 clusters is present in 88% of the National Institutes of HealthHuman Microbiome Project (NIH HMP) stool samples, and they are tran- scribedunder conditions of host colonization. We present evidence that the active formof these mole- cules is the initially released peptide aldehyde, which bearspotent protease inhibitory activity and selec- tively targets a subset of cathepsinsin human cell proteomes. Our findings show that an approach combiningbioinformatics, synthetic biology, and heterologous gene cluster expression canrapidly expand our knowledge of the metabolic potential of the microbiota whileavoiding the challenges of culti- vating fastidious commensals.

笔者大程微信号 mzqjcbx