豆瓣酱制曲工艺条件优化

 

摘要：以蚕豆瓣为主要原料，以蛋白酶活为评价指标，研究了米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（Aspergillus sojae）孢子粉对豆瓣制曲工艺的影响。通过单因素试验分别研究了面粉添加量、制曲温度、制曲时间、接种量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响。在单因素试验基础上进行正交试验，对制曲工艺条件进行优化。结果表明，最佳制曲工艺参数为制曲温度28℃，制曲时间56 h，接种量2%，面粉添加量为10%，在此工艺条件下，蛋白酶活力为762 U/g。

关键词：蚕豆瓣；制曲；米曲霉；酱油曲霉；蛋白酶活力

蚕豆曲的制备是豆瓣酱制作的一个关键过程，好的蚕豆曲其菌株生长旺盛，为后发酵过程提供所需的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、转氨酶等酶类。这些酶将大分子物质降解成多肽和游离氨基酸，其中蛋白酶活性的高低直接影响了豆瓣酱产品的质量，因此蛋白酶活力是评价成曲质量的重要指标。近年来，有关蚕豆曲制备的研究报道也越来越多。如杨进等[1]在传统工艺的基础上，研究了米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger）单独制曲的温度、接种孢子量、制曲时间等条件，确定了米曲霉和黑曲霉的最佳制曲工艺。李志江等[3]采用单因素试验，确定了米曲霉和黑曲霉（质量比为1∶1）混合制曲的最佳工艺条件。贡汉坤[4]利用4因素3水平的正交试验得到了米曲霉和酱油曲霉混合制曲时的最佳工艺条件：菌比例1∶1，制曲时间64 h，制曲温度28℃，接种量1%。蚕豆曲质量的优劣会对原料的利用率和产品的色泽、风味、理化指标等产生直接的影响，为后期得到色泽好、口感佳的蚕豆酱，该阶段应保持菌种良好的生长状况，并且尽可能产生更丰富的蛋白酶等生物酶系。

本研究从制曲时间、制曲温度、面粉添加比例和接种量出发，在制曲过程中加入米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（Aspergillus sojae），以蚕豆曲的蛋白酶活力为指标，采用单因素和正交试验探讨了不同的制曲条件对成曲中蛋白酶活力的影响，旨在为提高蚕豆酱的品质提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕豆瓣：蜀香茗四川特产商城，存储于-4℃冰箱备用；面粉：山东鲁王集团有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（Aspergillus sojae）：筛选于蚕豆曲；曲精：米曲霉和酱油曲霉分别制得的孢子粉；氢氧化钠、三氯乙酸、干酪素、酪氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；福林-酚试剂（分析纯）：上海源聚生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MP502B型电子天平、JA2003型电子天平：上海精科仪器有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台：苏州华科净化技术有限公司；303型电热恒温培养箱：上海树立仪器仪表有限公司；GI36TW型高压灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；DK-S24型电热恒温水浴锅：广东环凯微生物科技有限公司；DHG90型电热恒温鼓风干燥箱：上海索谱仪器有限公司；DragonMed型手动单道可调式移液器：大龙医疗设备（上海）有限公司；XW-80A型微型漩涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制曲工艺流程[4-5]

曲精制备：将米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（Aspergillus sojae）接种到麦麸培养基上，置于30℃培养箱中进行培养，间隔24 h摇瓶翻曲，以防曲料结块。48～72 h后得到大量孢子的培养物，分离孢子得到曲精，放于4℃冰箱中保存备用。

面粉处理：将面粉置于121℃高压灭菌锅内灭菌15 min，之后无菌下过60目筛备用。

混合接种：蚕豆瓣出锅后，无菌下摊在纱布上晾干表面水分并冷却至室温后，与一定质量比例的面粉和曲精混合均匀（面粉和曲精先混合均匀），在28℃的恒温培养箱中培养2～3 d，待蚕豆表面长满黄绿色孢子后即得到所需的蚕豆曲。

1.3.2 样品粗酶液的制备

称取两份10 g的蚕豆曲，一份在研钵内加入少量蒸馏水充分研细并定容至100 mL，在40℃水浴内间断搅拌1 h，用四层纱布过滤得到粗酶液；另一份测量水分含量。

1.3.3 蛋白酶活力的测定方法

蛋白酶活力的测定参考丁祖志等[5-7]方法，采用福林-酚试剂比色法测定。蛋白酶活力定义：在40℃中性pH条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需要的酶量为一个蛋白酶活力单位，以U/g来表示，重复3次取平均值。

1.3.4 制曲工艺的单因素影响试验

蒸蚕豆瓣出锅后，在无菌条件下与面粉、米曲霉和酱油曲霉孢子粉（质量比1∶1）混合均匀（面粉和孢子粉先混合均匀），恒温培养一定时间后，每隔12 h取样，检测其蛋白酶活力，每个样品做2个平行。考察面粉添加量（5%、10%、30%、50%、70%）、米曲霉和酱油曲霉孢子粉接种量（0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、制曲温度（25℃、28℃、30℃、32℃、35℃）、制曲时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）对蚕豆曲蛋白酶活力的影响。

1.3.5 正交试验

在单因素试验的基础上，对制曲温度（A）、制曲时间（B）、米曲霉和酱油曲霉孢子粉（1∶1）接种量（C）、面粉添加量（D）进行4因素3水平的正交试验。以蚕豆曲蛋白酶活力为评价指标，选用L9（34）正交设计试验来确定蚕豆曲制备的最优培养条件。正交试验设计因素与水平见表1。

表1 制曲工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for koji-making process optimization

水平A制曲温度/℃D面粉添加量/% 12510 2 2830 33050 B制曲时间/h 40 48 56 C接种量/% 1.0 1.5 2.0

2 结果与分析

2.1 制曲时间对蚕豆曲蛋白酶活力的影响

制曲时间对蚕豆曲蛋白酶活力的影响，结果如图1所示。

图1 制曲时间对蚕豆曲蛋白酶活力的影响
Fig.1 Effect of koji-making time on protease activity of broad bean koji

由图1可知，随着制曲时间的延长，蚕豆曲蛋白酶活力逐渐增加，当制曲时间为48 h时，蚕豆曲的蛋白酶活力达到最大值，为687 U/g；继续增加制曲时间，48 h后酶活力有所下降，但基本保持稳定。制曲过程曲料无结块，表面有大量绿褐色孢子产生，颜色均匀，霉香味浓郁，基本无氨味，初步确定蚕豆曲的制曲时间为48 h。

2.2 制曲温度对蚕豆曲蛋白酶活力的影响

制曲温度对蚕豆曲蛋白酶活力的影响，结果如图2所示。

图2 制曲温度对蚕豆曲蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity of broad bean koji

由图2可知，当制曲温度为28℃时，蚕豆曲蛋白酶活力达到最大值，为701 U/g；曲料蓬松、颜色均匀、基本无氨味及其他不良气味。28℃以后蛋白酶活力随着制曲温度的升高而显著降低。制曲温度超过32℃后，蛋白酶活力明显下降，可能是当温度过高时，出现严重的烧曲现象，不利于霉菌的生长和繁殖，最后使蚕豆曲中蛋白酶活力降低。初步确定适宜的制曲温度为28℃。

2.3 面粉添加量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响

面粉添加量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响，结果如图3所示。

图3 面粉添加量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响
Fig.3 Effect of koji-making flour bean addition on protease activity of broad bean koji

由图3可知，随着面粉添加量的增大，蚕豆曲蛋白酶活力呈先增加后下降的趋势；当添加的面粉添加量为10%时，制成的蚕豆曲的蛋白酶活力最高686 U/g，继续增大面粉添加量，酶活力有所下降，原因可能是面粉添加过多时影响到霉菌的生长代谢，从而导致蚕豆曲中蛋白酶活力下降，初步确定最适面粉添加量为10%。

2.4 接种量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响

接种量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响，结果如图4所示。

图4 接种量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响
Fig.4 Effect of koji-making inoculum on protease activity of broad bean koji

由图4可见，随着接种量的增加，蚕豆曲蛋白酶活力逐渐增加，当接种量为2%时，蚕豆曲的蛋白酶活力达到最大值709 U/g，此时的蚕豆曲制成的蚕豆曲孢子浓密，颜色深，初步确定最适接种量为2%。

2.5 正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，选择制曲温度（A）、制曲时间（B）、米曲霉和酱油曲霉（1∶1）孢子粉接种量（C）、面粉添加量（D）为评价因素，以蚕豆曲蛋白酶活力为评价指标，进行正交试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2 制曲工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for koji-making process optimization

试验号ABCD蛋白酶活力/（U·g-1）123456789k1k2k3 111222333 123123123 123231312 123312231 496 536 583 592 670 682 463 487 517极差R 538 648 489 160 517 564 594 77 555 548 572 24 561 560 554 7主次顺序A＞B＞C＞D最优水平A2B3C3D1

表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。

变异来源平方和自由度均方F值P值显著性ABCD误差79 483.11 18 099.11 1 787.111 179.111 1 30 22229 39 741.56 90 49.556 893.555 6 89.555 6 3.333 3 11 922.47 2 714.867 268.066 7 26.866 7 0.000 1 0.000 1 0.000 1 0.000 2 ** ** ** **

由表2可知，试验中的4种因素对蚕豆曲蛋白酶活力影响的大小顺序依次为A＞B＞C＞D，即制曲温度对蚕豆曲的蛋白酶活力影响最大，其余影响因素依次是制曲时间、接种量和面粉添加量。通过直观的极差分析方法可知，制曲的最佳工艺组合为A2B3C3D1，即制曲温度28℃，制曲时间56 h，接种量2%，面粉添加量10%。在此条件下进行验证试验，测定蚕豆曲蛋白酶活为762 U/g，高于正交试验结果。

由表2可知，A、B、C、D4个因素对蚕豆曲蛋白酶活力的影响均为极显著（P＜0.01）。且根据F值大小可知，4因素影响主次顺序为制曲温度＞制曲时间＞接种量＞面粉添加量，与极差分析结果一致。

3 结论

本研究蚕豆瓣为原材料，考察制曲温度、制曲时间、米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（Aspergillus sojae）孢子粉接种量、面粉添加量对蚕豆曲蛋白酶活力的影响。通过单因素和正交试验对影响蚕豆曲蛋白酶活的因素进行了筛选和优化，最终得出了豆酱制曲工艺的最佳条件为制曲温度28℃，制曲时间56 h，接种量2%，面粉添加量10%。在此条件下，获得的蚕豆曲蛋白酶活力为762 U/g。

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Optimization of the koji-making technology of broad bean paste

LIU Yunzhen,XU Xilin,LIU Yongqi,LIU Dongmei*
(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Abstract：Using the broad bean as the main raw material,protease activity as the evaluation index,the effect ofAspergillus oryzaeandAspergillus sojaeon the koji-making of broad bean was researched.By single factor experiments,the effect of flour addition,koji-making temperature,time,and inoculum on the protease activity were researched.On the basis of single factor experiments,the koji-making process conditions were optimized by orthogonal experiment.The results showed that the optimum parameter of koji-making process were temperature 28℃,time 56 h,inoculum 2%and flour addition 10%.Under the conditions,the protease activity was 762 U/g.

Key words：broad bean;koji making;Aspergillus oryzae;Aspergillus sojae;protease activity

中图分类号：TS264.2

文章编号：0254-5071（2016）11-0108-04

doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.022

收稿日期：2016-07-06

基金项目：广东省农业攻关科技计划项目（（2012B020311002）

作者简介：刘云珍（1991-），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。

*通讯作者：刘冬梅（1972-），女，副教授，博士，研究方向为食品微生物利用与控制研究。