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热图（heatmap）是分子生物学文章里（尤其是RNA-seq相关论文）经常出现的图片。但热图一般有哪些用途，具体涉及哪些不同的参数画法，不一定所有的人都清楚。本篇短文，我们来说一说这个问题。 1. 关于热图的用途 热图的用途一般有两个。以RNA-seq为例，热图可以：1）直观呈现多样本多个基因的全局表达量变化；2）呈现多样本或多基因表达量的聚类关系。 第一个问题很容易理解，毕竟使用颜色（例如红绿的深浅）来展示多个样本多个基因的表达量高低，既直观又美观。 第二个问题，则需要考虑：你是否要做聚类，是对样本聚类还是对基因聚类。 先介绍需要聚类的情况。例如，对于下图，就是利用12个基因的表达量（右侧字符为gene ID）对48个包含正常人和病人的样本（下方字符为样本ID）进行聚类的结果。我们很容易观察到图中人群在系统关系上（图上方的树形结构）分为了两类。由此，我们从中了解了两类人群的基因表达模式，并对他们进行了分类。如果深入一点讲，这种聚类本质上利用了多组值间两两的差异程度（欧式距离、相关系数等），对多组值进行层级聚类，以最终得到样本间聚类的远近关系。
因此，如果你关心样本（或基因）在检测到的表达量水平如何分类，相关关系如何，那么你可以选择聚类。在这里，你还可以选择：仅在样本水平聚类、仅在基因水平聚类或两者都选择（如图1）。 但并非任何时候，聚类都是最佳的选择。尤其，当你预先设定好的样本排序或基因排序已经很有生物学意义，并且想在最终的图片中呈现，就应该放弃聚类。例如，你已经按照一个代谢通路对基因排好序，只想通过热图展示这条通路上基因的表达量如何变化。因为聚类会将原来很有生物学意义的基因排列打乱了。那么选择不聚类，维持原来数据的排序就是最好的选择（如图2）
2. 热图中绘制软件和参数 如果你对R语言有所了解，那么R软件包中的ggplots是不错的选择。如果你不懂这些编程语言，也有其他简单易用的热图绘制软件供选择，例如我们10月30日的文章中介绍的heml1.0。同时热图绘制中主要涉及的几个关键参数，我们最后再介绍一下： 聚类： 也就是上文提到的，是否聚类（是按行聚类、按列聚类还是两者都选），一般软件有这样的选项。例如在R语言ggplots 的heatmap.2 命令中的参数Rowv（行聚类）和Colv（列聚类）。 大家如何仔细看热图，一定会发现图旁边一般会有一个图例（如下图）：
大部分热图图例的变化范围极小，一般是以0为中心，变异范围在±3以内。这是由于绘图的数据通常变异范围极大。例如RNA的表达量，低丰度的基因的表达量可能在RPKM<10以内。而高丰度基因则RPKM值可以达到10000+。如果不对数据进行均一化，很难在同一套颜色变化幅度范围内展现如此大尺度的数值变异。通常，热图软件都可以选择对绘图数值进行标准正态分布化（Z score）。也就是将一组值通过均一化，使其符合均值为0，方差为1的标准正态分布。 这里又将涉及到一个问题：我们是选择按行均一化、按列均一化还是对所有值均一化。 按行均一化：将每一行数值分别单独处理，使其符合标准正态分布； 不同处理方式，背后的意义也会有所不同。例如，如果在聚类过程中，你想让高表达的基因对样本的分类起到更大的作用，那么选择“对所有值均一化”也是较好的选择。但通常在热图绘制过程中，我们一般是以基因为单位来观测这些表达量数值的变化的。这意味着，这些基因无论表达量高低，其地位理论上是平等的（至少也是相似的）。即，如果A基因表达量从10变化到20，B基因表达量从100变化到200，我们更关心它们变化的倍数（都是2倍）而不是变化的绝对值（10 vs 190）。那么，我们应该以基因为单位进行归一化。例如在图1中，每一行代表一个基因，则我们应该选择按行进行均一化。 按基因均一化，可以最大程度地呈现每一个基因的变化信息，避免一个超高表达的基因掩盖了其他基因的变化。因此，在热图绘制中，这是常用的归一化策略。 |
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