仍是一如既往的经费问题!!!小白木有外聘砖家!!木有砖家! 但,勤劳勇敢的小白管理员们并没有放弃:在某一夜黑风高夜,他们施计打晕某两位具有江湖地位的人士,窃取了一手资料! 有了它~~~做好实验,出任CEO,赢取白富美,走向人生的巅峰~~指日可待。 #文件开启密令#有了小白,他好,我也好! How it works 对于某些生物或者细胞系中的蛋白质功能鉴定,有时我们需要构建出特定的蛋白质突变体,以获得不同的蛋白质功能表型。而随着基因编辑技术的出现,使真核细胞基因组中针对特定基因的同源重组编辑变得容易。(Fig.1) Fig.1(1) 第一页真核细胞中,HDR和NHEJ,是基因组上出现双链断裂时才会启动的、细胞自身的保护机制。NHEJ通常会引起插入或缺失突变; 第二页而HDR通常不会引起突变,因为在正常修复过程中会以另一条同源染色体为模版,但当有人工模版存在时,就可以实现定向编辑。 (Fig.2 图来自THE SCIENCE OF EXZACT™) 借由人工模版,就可以在真核生物和细胞系中进行基因的定向敲除、构建不同表型、引入外源基因或报告基因,甚至可以对染色体进行部分删除或倒位。 How to Design 同源臂的设计1使用单链DNA作为模版单链DNA模版的长度设计,单侧同源臂长度不低于40 nt; Notice1 但强烈推荐设计~90 nt。使用反义链作为模版优于正义链 Fig.3 不同同源臂长度下,同源重组效率(2) 2使用双链DNA作为同源重组修复模版线性化载体或者PCR产物皆可; Notice2 推荐同源臂在1000 nt左右,最低不能低于250bp。 可以在同源重组的模版中引入酶切位点,这样就可以用限制性酶切多态性实验(RFLP),很方便的检测基因编辑系统是否有效。具体fig.4。 Fig.4 Cas9介导同源重组(3) 小菊花麻麻课堂开课啦~~~Design,我们要注意什么 小菊花 小菊花麻麻 发生双链断裂后,同源重组修复(HDR)与非同源重组修复(NHEJ)在真核细胞中同时存在,这种现象在生物进化中存在重要意义。 然而,当真核细胞处于细胞周期的G2期和S期末期时,同源重组修复(HDR)才会发生,因为只有此时姐妹染色体才能从组蛋白中挣脱,作为HDR的模版。 而非同源重组修复(NHEJ)发生于G1,S,G2期。控制细胞周期针对性提高同源重组修复HDR或者非同源重组修复NHEJ就成为可能。 使用不同抑制剂锁定细胞周期,但是使用细胞周期抑制剂可能引起部分细胞凋亡,需要预实验探索最适浓度。 小菊花麻麻 更直接一点的方式是,抑制两种修复方式的一种,来增强另一种的效率。通常我们会抑制NHEJ,来增强HDR的效率。比如使用NHEJ的抑制剂Scr7,可以使同源重组修复(HDR)效率显著提高。 使用非同源重组修复(NHEJ)的抑制剂Scr7,可以使同源重组修复(HDR)效率显著提高 ,加入时机和终浓度参照参考文献,敏感细胞系请预实验探索最适浓度。 Fig.8 (1) How to do 顺利的情况下整套操作下来至少需要4周时间(心急吃不到热豆腐嘞~~),其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤。流程见图: Fig.7 Cas9敲除/敲入基因时间安排(3)
通过GFP或者puromycin富集成mixture,然后直接PCR测序或者利用Restriction-fragment length polymorphism (RFLP) 分析方法。 写在最后 目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系(包括ES细胞等)/受精卵(Zygote)中操作,因为效率还是比较高的。对于操作细胞系来说,结合单克隆挑取,往往可以获得100%的矫正。对于小鼠受精卵注射操作,也可以达到>50%的效率(被矫正的后代占全部后代的百分比)。 BUT 对于成年动物的矫正则未必能work。虽然现在有更小的Cas9-saCas9可以被包装成AAV特异性的导入到小鼠某个组织或者器官,但效率往往并不高;再加上同源重组的效率会进一步降低。 又but 研究者依然可以去try,比如在新生鼠时期利用AAV-saCas9进行局部注射编辑和重组效果可能会好一些。AAV-Cas9作为目前最流行的工具组合起来使用,一定是将来几年最热门的研究热点。将来某一天,也许会产生可以上市的AAV-Cas9基因治疗药物。 参考文献1.Yamamoto T. Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases[M]. Japan: Springer Tokyo Heidelberg New York Dordrecht London, 2014 2.Lin S, Staahl B T, Alla R K, et al. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery[J]. Elife, 2014, 3: e04766. 3.Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, and Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(11):2281-308. 4.Maruyama T, Dougan S K, Truttmann M C, et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(5): 538-542 5.Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, and Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;153(4):910-8. 6.Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D, and Li J. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013;13(6):659-6 7.Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015;520(7546):186-91. 8.Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, Thakore PI, Moreb EA, Castellanos Rivera RM, Madhavan S, Pan X, Ran FA, Yan WX, et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016;351(6271):403-7. 竟然能偷摸学完如此教程!!!感觉身体被掏空~~~ |
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