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治疗性单克隆抗体（mAb）作为抗感染剂和免疫调节药物，主要用于癌症治疗，是制药行业最活跃的研究和开发领域之一。抗肿瘤抗体药物包括未偶联完整的抗体或片段，抗体药物偶联物，抗体同位素和双特异性抗体等。这些抗体分子不是小分子化学药物，而是复杂的生物学分子，其具有多个并且通常复杂的机制，测量其生物学活性需要专门的技术，因此充分地了解mAb的作用机制进而在早期临床前阶段选择最佳的候选抗体药物是十分重要的。 众所周知，化合物分子的功能是由其结构决定，mAb也不例外。抗体由抗原结合域（Fab）和可结晶区域（Fc）组成。Fab主要特异性识别肿瘤相关抗原，进而调控下游的信号通路。Fc可以识别并结合表达Fc受体的免疫细胞以及血液中的补体进而介导抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）, 抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）以及补体依赖的细胞毒作用（CDC）等效应功能，Fc还可以结合FcRn从而在体内不被轻易清除而延长了其在机体内的半衰期。抗体的作用机制比较复杂，可以参考之前的文章《一图看尽67个抗体药物靶点和作用机制》。在这里根据抗体的结构，我们将其作用机制分为Fab相关的作用机制和Fc相关作用机制。 在这里，我们将介绍目前应用最为广泛的单克隆抗体，即免疫球蛋白（IgG）的作用机制。 一、Fab相关的作用机制 1）识别游离的靶点的单抗 游离存在于血液循环中的细胞因子、促血管生成因子、生物毒素等都可以作为单抗的作用的靶点。蛋白因子通过与受体的结合，传导信号进入细胞，调控细胞的功能。过量表达的蛋白因子传导过量的信号，打破细胞的正常功能。毒素和病毒等也必须通过与细胞表面的受体结合进入细胞内部从而发挥作用。中和抗体的作用机制就是通过结合抗原进行中和，使抗原丧失结合受体的能力，进而丧失生物学功能。常见的针对游离靶点的抗体有血管内皮生长因子（VEGF）抗体，肿瘤坏死因子（TNF）抗体，炭疽毒素中和抗体等。 2）识别细胞表面受体的单抗 每一种抗体都可以特异性结合特定的抗原靶点。靶点抗原表达在特定细胞表面，具有特定的功能，例如细胞激活、生长或迁移。根据抗体的Fab活性，可以分为结合、拮抗和激活（图1）。结合型抗体只是结合在靶蛋白表面但并不影响其功能。因此，靶蛋白受体的配体仍然可以与其结合，从而传递信号。结合性抗体可以用于标记靶细胞，从而让其Fc产生效应功能或通过搭载毒素从而杀灭靶细胞。拮抗性抗体封阻受体上的与配体相互作用所需的表位，阻止配体结合产生的信号传导。常见的那他珠单抗和达替珠单抗均为拮抗性抗体。激活型抗体模拟配体的功能，识别结合靶受体并传导信号至细胞内部。基于被激活的细胞内信号强弱，激活型抗体可能在治疗时使得靶细胞被激活并释放细胞因子，进而产生副作用。 图1 识别细胞表面受体的单抗的作用机制(Fab dependent) 二、Fc相关的作用机制 单克隆抗体通过其Fc部位结合各种Fc?Rs,进而发挥其效应功能，包括ADCC, ADCP和CDC（图2）. 以最常见的IgG1为例，其Fc区域通过结合Fc?RIII（CD16A）激活NK细胞诱导ADCC；与巨噬细胞上Fc?RIII（CD16A），Fc?RII（CD32A）和Fc?RI（CD64）结合，引发ADCP；与补体的C1q结合激活补体引发CDC。Fc 还能够以pH依赖的方式结合新生的Fc受体（FcRn），避免被核内体降解，从而延长单克隆抗体的半衰期。 图2 单抗隆抗体（IgG1）作用机制(Fc dependent) 1）ADCC ADCC作用是一种细胞介导的免疫防御机制，在靶细胞膜表面抗原结合了特异性的抗体的情况下，激活免疫系统的效应细胞进而裂解靶细胞的作用。因其对已存在的抗体的依赖性，ADCC作用是适应性免疫反应的一部分，也是体液免疫反应的一部分，用于限制和消除感染。经典的ADCC作用由NK细胞介导，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能介导ADCC作用。比如嗜酸性粒细胞能通过ADCC作用杀死某些特定的寄生虫。 体外检测ADCC效应有几种方法，一种是标记靶细胞的方法：比如用51Cr或具有膜通透性的甲基酯荧光染料，比如calcein-AM or DELFIA-BATDA，靶细胞标记后，加入抗体孵育，然后再加入NK92/CD16A细胞或者从PBMC纯化的NK92，或者PBMC作为效应细胞，不同的效应细胞和靶细胞的比例(E:T)，不同的孵育时间(通常低于4小时，更长的孵育时间也是可以的，只是自发释放会相应变大)。孵育结束后，加入enhancing solution，用不同的仪器检测放射性同位素和荧光染料，这些方法相对可信但灵敏度不够。其他一些方法，例如检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放，这个方法的缺点是由于靶细胞没有被标记，不能区分效应细胞和靶细胞的释放，所以也没有被频繁使用。最有吸引力的检测ADCC效应的方法是基于流式细胞术法（FACS）检测，这种方法通常需要标记靶细胞，或者同时标记靶细胞和效应细胞，然后检测靶细胞的活细胞的减少量，然而这种方法相对比较复杂，因为FACS检测时出现至少两群细胞（包括靶细胞和效应细胞），这需要染双色或者三色。相比较其他，用FACS 方法检测ADCC相对可靠，最终结果需要一个独立的方法来验证。无论使用哪种方法，效应细胞通常是PBMC或纯化的NK细胞。效应细胞需要用IL-2预活化过夜以增强效应细胞的活性，但由于个体的差异，以及FcR?IIIA多态性（158（V或F））的原因，导致同一个抗体的每次ADCC实验数据差距很大，可重复性差，而使用NK细胞系稳转CD16A，使体外ADCC实验变得更稳定，可重复性强。 提高抗体对Fc受体的亲和可以提高通过改造抗体Fc部位的糖基化和氨基酸序列来实现，具体可详见之前的文章《治疗性单抗的亚型选择与Fc区域改造》。 2）ADCP 众多小鼠体内实验表明，IgG1的治疗性抗体作用与巨噬细胞及其表达的Fc?Rs尤其是Fc?RIV高度依赖（表1），这些细胞不会引发高效的ADCC效应但是会引发ADCP效应，所以了解ADCP的作用机制也是很有必要的。
测定抗体的ADCP 与ADCC类似，都取决于共孵育的两种细胞：适应的靶细胞加入到效应细胞中（巨噬细胞或中性粒细胞），共孵育1-2小时，有时候也需要更长的孵育时间。巨噬细胞是贴壁细胞，需要消化后通过流式来分离。与ADCC类似，巨噬细胞的可重复性太差。所以也可以用细胞系，比如THP1，它通常需要被佛波酯激活，但是它的ADCP效果比较弱，需要孵育较长的时间。效应细胞通常是从PBMC通过免疫亲和方法富集或纯化而来。然后在血清或生长因子例如GM-CSF和/或M-CSF存在下，将它们体外分化4-7天。因此，效应细胞可以广泛变化，不仅是由于供体关联的Fc?Rs多态性，而且还由于单核细胞来源，纯化程序，分化成巨噬细胞的时间和条件等。所有这些事实意味着吞噬作用不容易标准化。 吞噬作用的测量依赖于基于显微镜或流式细胞术的方法。基于显微镜的技术是费力的，而且容易受到操作者的偏见。流式细胞术方法快速和定量，但容易产生伪像，因为样品中至少有两个不同的细胞群体存在。此外，即使进行靶细胞和效应细胞的差异标记，双重阳性事件也不能将结合和吞噬区分开来（图3）。在某些实验条件下，靶细胞可能与巨噬细胞结合，但不能被吞噬。此外，靶细胞和巨噬细胞之间的简单接触可能导致荧光从一个细胞传递到另一个细胞，但不存在吞噬作用。因此，双阳性细胞可能不代表真正的吞噬作用。有几种方法可以消除这些问题，例如通过猝灭结合但不摄取的靶细胞的荧光，染料仅在达到溶酶体的酸性环境时变为荧光，因此仅标记能够吞噬的靶标或者用第三个荧光标记物标记结合但非吞噬的靶标以区分结合和吞噬作用（图3）。基于这些，流式细胞术分析相对可靠。 图3 区分结合和吞噬原理示意图 3）CDC 补体是存在于人或脊椎动物血清于组织液中一组不耐热的，经活化后具有酶活性的蛋白质，共包括30余种可溶性蛋白和膜结合型蛋白。抗体的Fc片段能够结合血清补体分子（C1q），继而形成膜攻击复合物（MAC）清除目的细胞。补体的激活过程是个级联过程（图4）。首先是识别阶段：抗原与抗体结合后，C1q能识别抗体上的补体结合点，并与之结合。由于C1q的构型发生改变，可激活C1r和C1s；在Ca2 存在下，形成具有酶活性的C1s。接着是活化阶段C1s 将C4分解成小碎片的C4a和大碎片的C4b，C4b可与细胞膜结合；C1s 激活C4后，再激活C2（分解成C2a和 C2b）；C2b与C4b结合，形成有酶活性的C4b2b（C3转化酶）。C3被C4b2b裂解在C3a和C3b两个片段，C3b与C4b2b相结合产生的C4b2b3b为经典途径的C5转化酶。最后为攻膜阶段 C5在 C4b2a3b的作用下裂解为C5a和C5b，C5b与细胞膜和 C6、C7结合，形成C5b67复合物，进而与 C8、C9分子联结成C5b6789复合体，即为攻膜复合体，造成细胞膜溶解。 图4 补体介导的细胞毒作用 虽然许多治疗性抗体恒定区都是人的IgG1的Fc，但它们激活补体的能力却有极大的不同。激活补体不仅需要靶细胞表面表达较高密度的抗原，也需要抗体分子的高特异靶向性，高靶向性才能结合多个C1q并且有效激活补体。另外，位于细胞表面或者一些游离的补体抑制剂能够有效阻断补体级联反应。肿瘤细胞在其细胞表面经常高表达一些补体抑制剂如CD46，CD55和CD59，这些分子能够保护靶细胞免受补体介导的杀伤作用。因此，基于以上这些多因素的存在，导致许多IgG1的抗体只具有非常弱的CDC作用。 与ADCC检测实验相比，CDC体外检测相对简单，先把靶细胞稀释至特定密度，加至96孔板中，然后加入梯度稀释好的抗体于37°孵育10-30min，然后加入补体，于37°孵育1-24h。但如果我们研究人的靶点以及其对应的嵌合抗体和人源化或是全人的抗体时，我们必须用人的血清，因为有些补体蛋白有物种特异性，特别是CD59。即使在前期的快速筛选抗体阶段会用到兔血清，但有意义的数据还是需要人血清的。小鼠的血清在CDC实验中效果很差而且鼠血清本身对靶细胞的毒性相当大。具体原因尚不清楚。因而用鼠血清做补体的CDC数据相对稀少。实验中，有不同的方法测量靶细胞的裂解。最常用的是用非渗膜的荧光染料PI （propidium iodide），它能结合已裂解细胞的DNA，但是不能穿透正常细胞的细胞膜，然后通过流式检测细胞的活率。LDH，calcein AM释放等实验也可以检测CDC作用。 |
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