外泌体促进T细胞扩增

今天我们要解读的文献题目为：“Hepatocyte-derived exosomes promote Tfollicular regulatorycell expansion during HCV infection”，研究的是丙型肝炎中肝细胞来源的外泌体促进囊泡调节性T细胞的扩增，让我们开始阅读吧。

摘要：丙肝病毒是一个全球性的问题，它能引起严重的肝脏疾病例如肝硬化及肝癌。对丙肝病毒的控制需要强烈的T细胞反应，然而CD4（+）的T细胞在慢性丙肝的病人中并没有起到它应有的作用。囊泡调节性T细胞是一类调节性T细胞用以抑制囊泡辅助性T细胞，并且可以促进能产生高亲和力抗体的B细胞生成。在这个研究中，我们研究了慢性丙肝肝室中囊泡调节性T细胞的积累情况，并且阐明了在其扩增过程中的细胞和分子机制。我们的研究表明囊泡调节性T细胞在慢性丙肝的病人中大量出现但在非病毒性肝炎或健康的样本中并未检测到。我们对从健康样本中提取出的外周血单核细胞和丙肝病毒感染引起的肝癌细胞共同培养，由于囊泡辅助性T细胞被抑制导致了外周血中大量的囊泡调节性T细胞扩增。此外，在丙肝病毒感染引起的肝癌细胞和扁桃体细胞共同培养导致生发中心的囊泡调节性T细胞大量扩增。值得注意的是，扩增是由包含TGF-β的外泌体介导的，这些外泌体是从丙肝病毒感染的肝细胞释放的。阻断外泌体相关的TGF-β或者外泌体释放抑制剂可以阻止TFR的扩增。

图1. HCV患者肝内T淋巴细胞调节细胞的鉴定。

 （A）肝Tfh和Tfr细胞的流式细胞仪检测。 选择来自肝门的CD45 +细胞去除肝细胞。 筛选淋巴细胞，然后排除CD56+ NK细胞和CD14 + / CD11b +骨髓细胞。然后调控CD4 +细胞以分析CXCR5 + PD-1 +细胞。在CXCR5 + PD-1 +群体中，通过CD25和Foxp3的共表达来鉴定Tfr。（B）CD45 +白细胞群体中CD4 + T细胞的百分比。（C）CD4 + T细胞群体中Tfh（CXCR5 + PD-1 +）的百分比。（D）CXCR5 + PD-1 +群体中Tfr（CD25 + Foxp3 +）的百分比。符号代表共有7名健康受试者，6名非病毒性肝炎（NVH）患者和8名HCV患者的个体患者。

图2.肝细胞中的HCV感染促进Tfr细胞扩增。 （A）来自健康受试者的PBMC与未感染或HCV感染的肝癌细胞共培养4天。通过流式细胞术评估PBMCs，以评估CXCR5 + PD-1 +群体中Tfr的频率。 A与Tfh和Tfr门控显示了一个代表性的实验。 （B）图中的符号表示个体供体，水平条表示在共培养后或单独培养PBMC时CD4 + T细胞，Tfh细胞和Tfr细胞百分比的每组中值。 Foxp3 MFI的条形图表示每组的平均值±SEM。 （C）扁桃体MNC与未感染或HCV感染的肝癌细胞共培养4天。 （D）图中的符号表示个体供体，水平条表示每组中CD4 + T细胞，Tfh细胞，Tfr细胞，Tfr绝对数的百分比的中值。 Foxp3 MFI的条形图表示平均值±SEM。 （E）在共培养前通过分选从健康的受试者PBMC中消耗Tfr细胞。在共培养的第4天，分析了Tfr的百分比。

图3.暴露于HCV感染的肝细胞导致增强的Tfr细胞的免疫抑制表型。 （A）扁桃体MNC与未感染或HCV感染的肝癌细胞共培养4天。 进行IL-10细胞内细胞因子染色。 示出了在Tfr细胞上选择的代表性流程图。 IL-10 +细胞根据未刺激的对照进行门控。（B）共培养后或当扁桃体MNC单独培养时，IL-10 + Tfr的平均百分比。 （C）共培养后IL-10 + Tfh的平均百分比。 （D）在未感染肝细胞（灰线），感染肝细胞（黑线）或CD25-Foxp3-CD4 + T细胞（灰色填充）培养后，Tfr上CTLA-4（表面和细胞内）表达的代表性直方图。 （E）平均CTLA-4 MFI在Tfr。

图4.与HCV感染的肝细胞共培养后降低的Tfh细胞功能。 （A）将PBMC与未感染或HCV感染的肝癌细胞共培养4天。进行IL-21，IFN-γ和IL-17的细胞内细胞因子染色。显示了在Tfh上的典型流程图。象限中的数字表示来自代表性实验的细胞因子+细胞的平均数。细胞因子+细胞根据未刺激的对照进行门控。 （B）在共培养后IL-21 + Tfh和IL-21（底部）的MFI的百分比（上）。 （C）共培养后IFN-γ+ Tfh的百分比（上）和IFN-γ（底部）的MFI。 （D）共培养后IL-17 +Tfh的百分比（上）和IL-17（底部）的MFI。 B-D中的数据点代表来自个体PBMC供体的数值。 （E）在与未感染的肝细胞（灰线），感染的肝细胞（黑线）或PBMC仅对照（灰色填充）共培养PBMC后，Tfh上ICOS表达的代表性直方图。（F）平均ICOS MFI在Tfh。

图5.Tfr细胞在与HCV感染的肝细胞共培养期间损害Tfh细胞细胞因子产生和增殖。 （A）Tfr细胞在共培养前通过细胞分选而消耗。刺激PBMC，然后细胞内细胞因子染色。 显示了在Tfh上的典型流程图。象限中的数字表示来自代表性实验的细胞因子+细胞的数量。 （B）条形图表示共培养±SEM后各条件下IL-21 + Tfh（左）和IFN-γ+ Tfh（右）的百分比。 （C）扁桃体MNC与HCV感染的肝细胞共培养4天。将Tfr与自体Tfh分选并共培养，以评估其抑制增殖的能力。 CFSE稀释的代表性流程图显示在第2天（上）和第5天（底部）。 （D）该图表示第5天增殖Tfh（CFSE低）的百分比

图6.肝细胞外泌体的特征及其对Tfr细胞扩增和Tfh功能的影响。 分离的肝外泌体通过电子显微镜（A），蛋白质印迹和流式细胞术（B）表征。 （C）在第4天，通过流式细胞术评价在存在或不存在外来体的情况下培养的PBMC，以评估CXCR5 + PD-1 +群体中Tfr的频率。 （D）条形图表示用外泌体培养后的Tfh和Tfr的平均百分比。 （E）在外泌体释放抑制剂螺环氧化物（5μM）或DMSO的存在下，与未感染或HCV感染的肝癌细胞共培养PBMC后第4天的Tfr百分比。 数据代表5个人的平均值±SEM。（F）在第4天，进行IL-21，IFN-γ和IL-17的细胞内细胞因子染色。 图中显示了IL-21 +，IFN-γ+或IL-17 + Tfh的平均百分比。

图7.来自HCV感染的肝细胞的外泌体直接作用于CD4 + T细胞，以TGF-β依赖的方式促进Tfr细胞发育。 （A）用CFSE标记分离的外泌体，并用PBMC培养24小时。对PBMC进行CSFE分析以评估与外来体的相互作用。 （B）左侧：单独培养CD4 + T细胞，来自未感染肝细胞的外来体或来自感染肝细胞的外泌体4天。右：CD4 + T细胞单独培养，外源体从未感染的PHH分离，或外源体在HCV感染的PHH感染后第12天分离4天。流式细胞仪检测Tfr频率。 （C）将外泌体与涂有抗CD63抗体的珠孵育，随后用抗CD63和抗TGF-β荧光抗体染色。然后在流式细胞仪上分析Beadbound外泌体。 （D）TGF-β阳性的珠/外泌体的平均百分数。（E）将外泌体与同种型或抗TGF-β阻断抗体一起温育，重新分离，并用CD4 + T细胞培养4天。通过流式细胞术评估CD4 + T细胞，以评估Tfr的频率。所示为CXCR5 + PD-1 +细胞上的典型流程图。 X-454545454545 X-20045 X- 20045 X- 20045 X- 20045 X- 20045 X- 20045 X- 20045 X- 20045 X- 20045X-图中的符号表示PBMC或CD4T细胞的单独供体。

参考文献：

Cobb D A, Golden-Mason L, Rosen H R, et al. Hepatocyte-derived exosomes promote T follicular regulatory cell expansion during HCV infection[J]. Hepatology, 2017.