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研究表明，miRNA在膀胱癌中异常表达，对促进或抑制致癌，发育，凋亡，侵袭和转移具有多重影响。circRNA可以充当“miRNA海绵”起作用，对miRNA产生负调控作用。然而，作为“miRNA海绵”的circRNA的功能尚未在膀胱癌中明确阐明。华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科曾甫清课题组李亚伟博士近期发表在《EMBO reports》的研究提供了circRNAs可作为“miRNA海绵”的证据，并提出了治疗膀胱癌的新靶点。 越来越多证据表明环状RNA（circRNA）在调节基因表达方面发挥关键作用。在本研究中，作者进行RNA-seq并鉴定人类膀胱癌和正常膀胱组织中的6,154种不同的circRNA。发现数百个circRNA在人膀胱癌组织中显著失调。进一步表明称为膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）的circHIPK3在膀胱癌组织和细胞系中显著下调，分别与膀胱癌分级，侵袭和淋巴结转移呈负相关。circHIPK3过表达可有效抑制膀胱癌细胞的体外迁移，侵袭和血管生成，并抑制体内膀胱癌生长和转移。机制研究表明，circHIPK3含有microRNA miR-558的两个关键结合位点，可以大量充当miR-558海绵来抑制乙酰肝素酶（HPSE）的表达。综上所述，本研究结果提供证据表明circRNAs作为“microRNA海绵”，并提出了治疗膀胱癌的新治疗靶点。
概要 1、circHIPK3在人膀胱癌组织和细胞系中下调 2、circHIPK3有效地在膀胱癌细胞中充当miR-558海绵 3、circHIPK3通过靶向miR-558/乙酰肝素酶轴来抑制癌症侵袭和转移
1、膀胱癌组织和正常组织CircRNA表达谱：RNA-seq（锐博生物提供） 2、circHIPK3鉴定及定位：RT-PCR、Sanger测序、Northern blot分析、RNA荧光原位杂交（锐博生物提供） 3、circHIPK3体外功能验证：circHIPK3表达载体转染、细胞划痕实验、transwell迁移和侵袭实验、siRNA 4、机制研究（circHIPK3充当miR-558海绵作用）：序列预测比对、miR-558/circHIPK3探针（锐博生物提供）、pull down、real-time PCR、miR-558 mimics、RNA FISH 5、miR-558体外功能验证：miR-558 mimics、anti-miR-558 inhibitor、real-time PCR、Western blot、细胞划痕与transwell实验 6、circHIPK3与miR-558相互作用研究：共转染实验、transwell侵袭、细胞划痕实验 7、circHIPK3体内功能验证：构建异种移植肿瘤（转移）模型、免疫组织化学 首先，作者通过RNA-seq鉴定circRNA。发现人类膀胱癌和正常膀胱组织中的6,154个不同的circRNA，其中有1,623个新的circRNA。有88.35%的circRNAs来源于外显子（图1A），其他来源于内含子、基因间区域、3’UTR和5’UTR等。膀胱癌组织中524个circRNAs显著下调，47个上调（图1B）。
然后作者选择了几种显著差异表达的circRNA来验证其在膀胱癌细胞系中的存在。RT-PCR分析发现circHIPK3在两种细胞系中稳定表达。circHIPK3（hsa_circ_0000284）来源于HIPK3基因，由外显子2（1,099bp）头对尾剪接组成，在膀胱癌组织中下调。Sanger测序确认了circHIPK3头对尾剪接及预期的大小（图2C）。
然而，头对尾剪接可以通过反式剪接或基因组重排产生。首先，作者设计收敛引物和发散性引物分别扩增HIPK3 mRNA和circHIPK3。发现circHIPK3仅能在cDNA中通过发散性引物扩增，在gDNA中没有扩增（图3D）。其次，Northern blot分析显示circHIPK3有预期大小条带。与此同时，检测HIPK3转录本的环状和线性形式发现RNase R可酶切线性的HIPK3片段而circHIPK3被保留，通过RT-PCR进一步证实（图3E,F）。 接下来，检测circHIPK3在膀胱癌组织与正常组织中的表达水平发现，与正常组织相比，79.5%的膀胱癌组织中circHIPK3的表达显著减少，分别与膀胱癌分级，侵袭和淋巴结转移呈负相关（图3G）。RNA荧光原位杂交表明circHIPK3主要位于细胞质（图3I）。
为了探讨circHIPK3在膀胱癌细胞中的功能，作者将circHIPK3表达载体转染到T24T和UMUC3细胞。显示circHIPK3的表达显著增加，过表达的circHIPK3对RNase R处理具有抗性，可被RNase R降解的HIPK3 mRNA表达无明显变化（图4A）。细胞划痕实验表明circHIPK3过表达显著抑制T24T和UMUC3细胞中的细胞迁移（图4B）。transwell迁移和侵袭实验显示circHIPK3过表达也抑制膀胱癌细胞系的迁移和侵袭（图4C,D）。
另一方面，作者将靶向circHIPK3连接位点的siRNA转染到T24T和UMUC3细胞中，以评估对circHIPK3和HIPK3 mRNA表达的影响。发现这些siRNA显著降低circHIPK3的表达，但对HIPK3 mRNA无影响（图5E）。转染最有效的circHIPK3 siRNA（si circHIPK3-1）后膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力增加（图5F-H）。这些结果表明，circHIPK3过表达可以抑制膀胱癌细胞在体外的迁移和侵袭。
为了确定circHIPK3是否能够在膀胱癌细胞中充当miRNA海绵的作用，作者通过数据库序列预测比对选择了12个候选miRNAs（图6A）。那么circHIPK3是否可以直接结合这些候选miRNA？作者设计并验证了生物素标记的circHIPK3探针在膀胱癌细胞系中可pull down circHIPK3，并且circHIPK3过表达稳定转染子中的下拉效率显著增强（图6B,C）。提取pull down后的miRNA，real-time PCR检测12个候选miRNA水平，显示miR-558是唯一一个在T24T和UMUC3细胞中被circHIPK3大量pull down的（图6D）。
CircHIPK3包含miR-558的6个预测结合位点。为了确认哪个结合位点是功能性的，作者在circHIPK3表达载体中突变了每个位点，以测试它是否仍然可以下拉miR-558。发现突变的circHIPK3也可以通过circHIPK3探针下拉（图7E）。随后，评估每个突变的circHIPK3下拉的miR-558的相对水平显示突变位点1或位点2后miR-558的相对结合显著降低，而其他4个位点的突变未显示出下降（图7F）。这些结果表明，结合位点1和位点2而不是其他四个结合位点对于circHIPK3充当miR-558海绵是至关重要。
接下来应用生物素标记的miR-558 探针进一步验证miR-558和circHIPK3的直接结合。real-time PCR检测circHIPK3与miRNA mimics或突变体的结合。发现与破坏circHIPK3和miR-558之间碱基配对的突变体相比，在野生型miR-558的捕获部分中circHIPK3的富集更高（图8G）。RNA FISH测定显示circHIPK3和miR-558共定位于细胞质中（图8H）。上述结果表明，circHIPK3可以直接结合T24T和UMUC3细胞中的miR-558。
224个定义明确的膀胱癌病例的Kaplan-Meier生存曲线显示，HPSE高表达患者的生存概率较差（图9A）。real-time PCR发现与对照相比，miR-558在膀胱癌组织及T24T和UMUC3细胞中均上调（图9B,C）。为了研究miR-558在膀胱癌细胞系中的功能，作者进行了miRNA的抑制和过表达实验。细胞划痕与transwell实验显示miR-558过表达显著促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭（图9D）。通过用miR-558 mimics转染的T24T和UMUC3细胞的预处理培养基处理HUVEC细胞，使得管形成能力也得到提高。相比之下，anti-miR-558 inhibitor的转染显著抑制T24T和UMUC3细胞迁移与侵袭，并抑制HUVEC细胞的管形成（图9C,E,F）。Real-time PCR和Western blot实验表明miR-558 mimics可增加膀胱癌细胞中HPSE，VEGF和MMP-9的表达，anti-miR-558 inhibitor则降低其表达（图9G,H）。这些结果表明miR-558可以通过体外靶向HPSE来显著促进膀胱癌的迁移，侵袭和血管生成。
为了确定circHIPK3是否通过与miR-558相互作用抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭，作者将miR-558 mimics和circHIPK3表达载体共转染膀胱癌细胞。与单独用miR-558 mimics转染的细胞相比，共转染的膀胱癌细胞中HPSE，MMP-9和VEGF的表达显著降低（图10A-D）。同时，transwell侵袭和细胞划痕实验表明，与miR-558 mimics转染的细胞相比，共转染的膀胱癌细胞显示出侵袭和迁移能力的降低（图10E,G）。此外，用miR-558 mimics和circHIPK3共转染细胞的预处理培养基处理HUVEC细胞导致管形成能力也下调（图10F）。这些数据表明circHIPK3通过充当miR-558海绵并且随后抑制HPSE的表达来抑制细胞迁移，侵袭和血管生成。 进一步研究了circHIPK3强制表达对体内调节肿瘤生长，转移和血管生成的影响。作者将circHIPK3表达载体或对照载体转染的T24T细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。发现构建的异种移植肿瘤的生长速度和肿瘤重量降低（图11A,B）。免疫组织化学显示HPSE，MMP-9和VEGF的表达被过表达circHIPK3抑制。此外，导致CD31+微血管和平均肿瘤内血管密度减少（图11C）。还通过尾静脉注射构建转移模型。结果显示circHIPK3转染裸鼠形成的肺转移菌群比对照组少（图11D）。这些结果表明，circHIPK3的强制表达有效地抑制膀胱癌体内生长，血管生成和转移。
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