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解螺旋公众号·陪伴你科研的第2031天
Noncoding RNA主要包括miRNA，lncRNA及circRNA，是最近几年的热门研究领域。其广泛参与生命活动的各种调节过程，且不编码蛋白，又被称为生物界的暗物质。miRNA目前已经研究的相对成熟，其主要作用是结合在基因的3’ UTR区，负向调节基因的表达。 LncRNA及circRNA是近期研究的主要内容， lncRNA的作用模式目前主要有Signal、Decoy、Guide及Scaffold，而circRNA作为一种更稳定ncRNA，因其富含miRNA的结合位点，可以发挥miRNA sponge的功能。miRNA sponge又被称为ceRNA，是一种自2011年以来被广泛研究的一种RNA间的调控机制。 今天为大家带来一篇Circulation的文章，题目是“Circular Noncoding RNA HIPK3 Mediates RetinalVascular Dysfunction in Diabetes Mellitus”。结合题目及摘要，该文章的 疾病是糖尿病视网膜病变， 主变量分子是circHIPK3， 表型是血管内皮细胞的功能（活性、增殖、迁移及成管）， 机制是ceRNA（miRNA Sponge）， 科学假设是：c-myb→circHIPK3→miR-30a-3p→VEGFC/WNT2/FZD调控视网膜血管内皮细胞的功能，从而促进糖尿病视网膜病变的发生发展。 本文论证逻辑严谨（补充材料中的Figure达到24个），包括了分子、细胞、动物、组织四个维度，内容包括以下几个部分： 第一部分，包括Fig1、7、S1、S2、S3，验证circHIPK3的表达及在糖网中的表达差异； 第二部分，包括Fig2、5、S6、S7、S8、S23，通过gain of function及loss of function验证表型； 第三部分，包括Fig5，寻找circHIPK3上游驱动机制； 第四部分，包括Fig3、S9-15、S24，寻找circHIPK3下游调控机制； 第五部分，包括Fig4、6、S17-21，机制的表型验证； 接下来具体看一下数据： 验证circHIPK3的表达及再糖网中的表达差异
S1、S3：血管内皮细胞中存在circHIPK3表达；S2：circHIPK3在人与小鼠直接高度保守
A、B：组织和细胞水平验证circHIPK3的表达；C:测序验证序列；D、E：circHIPK3较HIPK3mRNA更稳定；F、G：circHIPK3主要定位于细胞质；H、I：在动物和细胞水平验证circHIPK3在糖网中表达升高。
Fig7 circHIPK3在糖尿病视网膜病变患者中高表达
A、B、D：circHIPK3在糖尿病患者的视网膜前膜、房水、血清中表达升高；C：circHIPK3在糖尿病患者外周血细胞中表达不升高。Fig2、S6、S7 敲降circHIPK3验证表型
Fig2A：siRNA1、SiRNA3降低circHIPK3内源性表达；Fig2B、S6A：敲降circHIPK3抑制细胞增殖；Fig2C、S6B：敲降circHIPK3抑制细胞迁移；Fig2D、S6C：敲降circHIPK3抑制细胞迁移；Fig2E、S6D：敲降circHIPK3抑制细胞成管；S7：在高糖环境下敲降circHIPK3抑制细胞活性、增殖、迁移、成管。
A：过表达circHIPK3；B：过表达circHIPK3促进细胞活性；C：过表达circHIPK3促进细胞增殖；D：过表达circHIPK3促进细胞迁移；E：过表达circHIPK3促进细胞成管。Fig5 敲降circHIPK3减轻糖网中内皮细胞损伤A：构建特异性敲降circHIPK3的shRNA；B:动物水平验证敲降circHIPK3后糖网小鼠视网膜血管增生减轻；C动物水平验证敲降circHIPK3后糖网小鼠视网膜血管渗出减轻。S23：动物水平验证过表达circHIPK3后加重糖网小鼠视网膜血管增生及渗出。S5 转录因子c-myb为circHIPK3上游驱动因素
A：c-myb在高糖环境下表达升高；B：PCR验证敲降c-myb后circHIPK3表达下降；C：ChIP验证高糖环境下c-myb与编码circHIPK3基因的启动子结合；D：Luciferase assay验证c-myb与编码circHIPK3基因的启动子结合。Fig3、S9 circHIPK3与3种miRNA结合发挥调控作用
Fig3A：RIP验证circHIPK3与AGO2结合；Fig3B：Luciferase assay验证circHIPK3与3种miRNA存在结合；Fig3C：Rescue，突变结合位点验证circHIPK3与3种miRNA的结合；Fig3D：RIP-qPCR验证circHIPK3与3种miRNA存在结合；S9B：IF验证circHIPK3与3种miRNA存在共定位。S12：PCR验证过表达3种miRNA后VEGFC、FZD4、WNT2基因表达下降；S13：PCR验证过表达3种miRNA后相关血管生成因子无明显变化。S14：Luciferase assay验证3种miRNA与VEGFC、FZD4、WNT2的3’UTR区结合；
S15：验证敲降circHIPK3后VEGFC、FZD4、WNT2基因表达降低。S24 circHIPK3，miR-30a-3p，VEGFC/FZD4/WNT2三者存在相互作用A：动物水平验证抑制miR-30a-3p增加VEGFC、FZD4、WNT2基因表达；B、C：动物水平验证通过RIP-qPCR验证miR-30a-3p分别与circHIPK3及VEGFC/FZD4/WNT2三者存在相互作用；D：动物水平验证VEGFC/FZD4/WNT2表达；E：动物水平验证敲降circHIPK3后，VEGFC、FZD4、WNT2的表达下降。S18：抑制miR-30-3p增加细胞活性、增殖、迁移及成管能力；
S19：高糖环境下抑制miR-30-3p增加细胞活性、增殖、迁移及成管能力。Fig4 circHIPK3-miR-30a-3p调控视网膜血管内皮细胞功能A：通过Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p验证二者相互作用调控细胞活性；B：通过Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p验证二者相互作用调控细胞增殖；C、D：通过Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p验证二者相互作用调控细胞成管。S17：通过Rescue操作circHIPK3及miR-30-3p验证高糖环境下二者相互作用调控细胞活性、增殖、迁移及成管。
S20：通过Rescue操作circHIPK3及VEGF验证二者相互作用调控细胞活性、增殖、迁移及成管能力。S21：通过Rescue操作circHIPK3、WNT2/FZD4验证二者相互作用调控细胞活性、增殖、迁移及成管能力。本文是一个分子+分子+分子+分子的四元变量结构，其中包括一组转录调控（蛋白-DNA交互）以及ceRNA调控（RNA-RNA交互），论证了主变量分子circHIPK3通过竞争性结合miR-30-3p调控VEGFC/FZD4/WNT2表达，而本身受到上游转录因子c-myb的调控，从而促进糖尿病视网膜病变的发生发展。本文分为以下几步论证：单变量论证：circHIPK3、miR-30-3p调控血管内皮细胞的功能（活性、增殖、迁移、成管）及糖网中血管的增生及渗出。二元变量论证：circHIPK3通过miR-30-3p调控视网膜血管内皮细胞功能，circHIPK3通过VEGF/WNT2/FZD4调控视网膜血管内皮细胞功能。直接作用论证：通过ChIP、Luciferase assay验证c-myb与circHIPK3启动子区域的结合；通过RIP、Luciferase assay正反验证miR-30-3p与circHIPK3，miR-30-3p与VEGF/WNT2/FZD4的结合。本分之所以能发在Circulation这种心血管领域顶级期刊上，首先是由于主变量circHIPK3非常新颖，其在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用是首次报道；其次，本文论证充分，数据扎实，包括了临床、细胞、动物、分子四个维度，每个维度都从多个角度采用多种实验方法来论证；而且，本文有2组直接作用机制，实验用到了RIP、ChIP、Luciferase assay等比较高级的试验方法；最后，circHIPK3本身存在于外周血中，且外周血中的含量与疾病具有相关性，具有进一步应用于液态活检中的潜力。好了，这篇文献就分享到这里，期待大家都能收获好的结果。点下“在看”，多根头发
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