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领悟科研，优人一步！大家好，我是晨星计划讲师冰糖。今天为大家带来一篇发表在小CDD，《Cell Death&Disease》上的文献。小CDD就是一般硕博们毕业求职的小梦想了，一本稳健的期刊，今年影响因子有所小涨，从5.9590涨到了6.3040。 本篇文章研究主题是直接机制里对新手最友好的ceRNA。在36策中酸菜校长跟大家讲过，蛋白算是直接机制中的老大哥，但也是对新手最不友好的，一个co-IP、pulldown实验分分钟把人搞得累觉不爱。如今RNA是爆款，而在“见微知著”中讲过，miRNA是对新手最最友好的分子类型了，可惜近些年来由于其套路的普及化已经失去了新鲜感，就好像漂亮的女明星无法承受岁月变迁，失去了美丽的容颜。ceRNA机制无疑是让这位女神焕发青春的法宝，且上手简单，加价不加工作量，大家快来跟我一起看看吧！本周品谈会从题目解读、文章要素、论证逻辑、数据分析几个方面来为大家剖析文献，最后总结一下全文。
1.主变量八成是LINC00665，毕竟是占据了C位的分子；2.本篇是一篇三元变量的文章，多半是直接机制，或者至少是半套直接机制； 3.这个”miR-379-5p/LIN28B axis”很有意思，看到miRNA做中间变量，我们要心里有个意识，这会不会是ceRNA机制？再加上看到主变量是个lncRNA，那我们心里有底了，这个，ceRNA基本没跑了。 4.另外题目里还给了我们疾病的信息是乳腺癌，表型没有展开讲，只是说是progression。表型：EMT，细胞增殖，迁移，侵袭——由于研究的表型较多，题目中并没有 展开说，模型：T47D、MDA-MB-231、BT549（实验中主要用到的乳腺癌细胞株）MCF7、BT474、MDA-MB-468（其他乳腺癌细胞株）实验方法：siRNA沉默操作、质粒转染过表达操作、克隆形成实验、MTT、EdU、划痕愈伤实验、Transwell小室实验、xenograft、免疫荧光染色、免疫组化染色、FISH、双荧光素酶报告实验、RIP（加粗者为直接机制实验）Marker：检测EMT表型时用到了EMT marker——N-cadherin、E-cadherin、Vimentin本文为“分子-分子-分子”三元变量（ceRNA研究文章套路）主变量：LINC00665——属于长链基因间RNA（lincRNA），一类命名比较规整的RNA，都是大写的LINC在前，跟着一串数字。这类lncRNA的编码区域位于两个基因中间，不与编码基因的内含子、外显子重叠。次变量1：miR-379-5p——复习一下11策“见微知著”的内容哈。给大家3秒钟，先自己回想一下知识点，看看能从这个名字里获得哪些信息。3，2，1。好，我们来一起看看。打头的miR当然意思就是miRNA了，379是数字编号，以miRNA的发现顺序来排名，5p是指该miRNA是从其前体的5’端茎环臂上产生最终成熟的miRNA。次变量2：LIN28B——编码基因，功能被研究得已经比较清楚了，是miRNA生物合成的抑制蛋白，对let-7的抑制早已大白于天下。科学假设：LINC00665竞争性地与miR-379-5Pp结合，阻止miR-379-5Pp与LIN28B阻遏LIN28B表达的能力，进一步上调LIN28B与let-7表达水平，促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT等表型，从而促进其进展。作为一篇SCI文章，单变量论证的逻辑与证据是不论多么高端的机制研究也绕不开的。当然如果直接机制做得好，工作足且机制新，动物模型验证等非必做项目可以酌情放水。所以几乎所有的湿实验文章都可以用“单变量论证+机制研究”来概括。我们先来看单变量论证证据。还记得酸菜校长的单变量十二字真言吗？对，就是“表达差异，正反回复，细胞动物”。（一）表达差异：FigS1——在TCGA数据库中查到的表达差异信息（二）正反回复：Fig.1，FigS2，Fig.2，Fig.3（三）细胞动物：Fig.1，FigS2，Fig.2，Fig.3前3个Figure讲了单变量的story，Fig1沉默Fig2过表达，Fig3把EMT表型单拎出来秀了几张漂亮图片。单变量的论证主要集中在前3个Figure，那么还有半部重头戏——直接机制论证逻辑。放在这篇文章来看，即ceRNA机制。（四）ceRNA证据：36策里第21策“蝶使蜂媒”中详细讲了ceRNA的论证证据，我们一起回顾一下：1.主变量与编码基因之间假定是ceRNA的机制，它们的表达应呈正相关；2.主变量与编码基因有正相关的调控关系，“你动我也动”，放在这个语境下，应该是“你高我也高，你低我也低”，不过一般只做一边，省下一半的工作量；3.验证miRNA可以抑制主变量和编码基因；4.直接机制，证明主变量和编码基因确实与miRNA结合，方式就是荧光素酶报告实验展示结合位点；5.当然是论证逻辑里必不可少的Rescue啦。此处必备论证关系应为两条，1）主变量依赖miRNA调控表型；2)主变量依赖编码基因调控表型，最后还有一道加分步骤，过表达主变量然后做AGO2抗体的RIP。1.主变量LINC00665与编码基因LIN28B表达成正相关且LINC00665和miR-379-5p在乳腺癌细胞中表达丰度高（Fig. 6）2.主变量LINC00665上下调能够影响编码基因LIN28B的表达（Fig.5）3.验证了miR-379-5p与主变量LINC00665（Fig.4A-C、E、F）、编码基因LIN28B（Fig.5A、C、D）的相互作用4.证明主变量LINC00665（Fig.4D）、编码基因LIN28B（Fig.5B）与miR-379-5p相互结合（双荧光素酶报告实验）（1）LINC00665通过调控miR-379-5p促进乳腺癌进展（Fig.S3）（2）LINC00665通过调控LIN28B促进乳腺癌进展（Fig.5E-I，FigS4） 这真是堪称典范的ceRNA的论证样板啊！证据链条丝丝入扣一条不落。快让我们来看图片数据进一步学习吧。
Fig.1 Depletion of LINC00665 inhibits breast cancer cell proliferation, migration, and invasion.（LINC00665的表达差异和表型验证，Fig.1验证了沉默LINC00665细胞增殖、迁移、侵袭这几个表型的变化）F1A：验证LINC00665在正常乳腺上皮细胞、乳腺癌细胞株（尤其是三阴性乳腺癌细胞株）表达差异，选择表达量高的细胞株做沉默，表达量低的细胞株做过表达F1B：沉默组MDA-MB-231、BT549细胞中LINC00665 siRNA处理效果验证F1C-E：验证细胞增殖表型：克隆形成实验、MTT、EdU（in vitro）F1F：验证迁移表型：划痕愈伤实验（in vitro）F1G：验证侵袭表型：Transwell小室实验（in vitro）Fig.2 Overexpression of LINC00665 promotes breast cancer progression.（LINC00665的表达差异和表型验证，Fig.2验证了过表达LINC00665细胞增殖、迁移、侵袭这几个表型的变化）F2A：过表达组T47D细胞中LINC00665 质粒处理效果验证F2B-D：验证细胞增殖表型：克隆形成实验、MTT、EdU（in vitro）F2E：验证侵袭表型：Transwell小室实验（in vitro）F2F-G：xenograft（细胞皮下移植瘤模型）实验（in vivo）Fig.3 LINC00665 induces an EMT-like phenotype.F3B：转录水平验证EMT markers在LINC00665过表达细胞中高表达F3C：翻译水平验证EMT markers在LINC00665过表达细胞中高表达F3D：免疫荧光染色验证EMT markers在LINC00665过表达细胞中高表达F3E：免疫组化染色验证EMT markers体外实验中在LINC00665过表达个体上高表达Fig.4 LINC00665 acts as a sponge for miR-379-5p.（机制研究一：验证LINC00665与miR-379-5p之间的直接相互作用——miRNA sponge）F4B：LINC00665在细胞核和细胞质的相对丰度（GADPH、U6是内参）F4C：预测的miR-379-5p与LINC00665的结合位点与mut序列F4D：双荧光素酶报告实验：验证miR-379-5p与LINC00665的结合位点F4E：RIP实验验证LINC00665和miR-379-5p分别都可以与AGO2蛋白直接结合F4F：验证沉默和过表达LINC00665分别对miR-379-5p表达的影响（沉默LINC00665, miR-379-5Pp表达量上升；过表达LINC00665,miR-379-5Pp表达量下降）Fig.5 LINC00665 promotes breast cancer progression by regulating the miR-379-5p/LIN28B axis.（机制研究二：miR-379-5p与LIN28B之间的作用关系，Rescue实验：LINC00665通过调控LIN28B促进乳腺癌进展）F5A：预测的miR-379-5p在靶基因上的结合位点序列F5B：双荧光素酶报告实验：验证LIN28B是miR-379-5p的靶基因F5C：mRNA水平验证LIN28B在miR-379-5p过表达细胞和沉默细胞中的表达差异F5D：蛋白水平验证LIN28B在miR-379-5p过表达细胞和沉默细胞中的表达差异Fig. 6 The clinical relevance of LINC00665, miR-379-5p, and LIN28B expression in breast cancer.Fig.7 A model of the role of LINC00665 in breast cancer progression.到这里正文就结束了，我们发现Rescue证据还差一条。客官莫急，随我这边来。我们来看看Supplementary里的Figure。Fig.S1 The expression of LINC00665 in breast cancer specimens from TCGA database.Fig.S2 Depletion of LINC00665 inhibits tumor growth in MDA-MB-231 cells.（补充Fig.1 的实验内容，in vivo实验验证增殖表型）FS2B-C：xenograft实验结果（补充沉默LINC00665之后观察表型的in vivo实验）Fig.S3 LINC00665 promotes breast cancer progression by regulation of miR-379-5p expression.（Rescue实验：LINC00665通过调控miR-379-5p促进乳腺癌进展）FS3A：Rescue实验：分三组，对照组、过表达LINC00665、过表达LINC00665+过表达miR-379-5p的质粒转染效果FS3B-D：Rescue实验：验证回复细胞增殖表型（in vitro）FS3E：Rescue实验：验证回复侵袭表型（in vitro）FS3F-G：Rescue实验：验证回复细胞增殖表型（in vivo）Fig. S4 The expression of let-7 in indicated cells.（let-7(LIN28B的已知作用机制）：进一步说明LINC00665调节表型依赖LIN28B）本篇文献是一篇比较中规中矩的ceRNA套路文章，Fig.1，Fig.2，Fig.3，FigS1，FigS2对主变量进行了单变量论证套路，“表达差异，正反回复，细胞动物”；Fig.4验证了LINC00665与miR-379-5p之间的直接相互作用——分子海绵；FigS3做了Rescue（反正正），证明LINC00665通过调控miR-379-5p促进乳腺癌进展；Fig.5，FigS4验证miR-379-5p与LIN28B之间的作用关系，做了Rescue（正正反），证明LINC00665通过调控LIN28B促进乳腺癌进展；Fig.6证明LINC00665与LIN28B的正向调控关系，以及分子表达量两两之间的关系。三元变量论证Rescue：“反正正”（FigS3，LINC00665与miR-379-5p）“正正反”（Fig5，LINC00665与LIN28B）1.主变量与编码基因表达成正相关且主变量和miRNA在乳腺癌细胞中表达丰度高3.验证miRNA与主变量、编码基因的相互作用与结合位点4.证明主变量、编码基因与miRNA相互结合（双荧光素酶报告实验）5.Rescue实验：主变量与miRNA，主变量与编码基因1.证明主变量lncRNA与miRNA有相互作用：①RIP ②荧光素酶报告实验2.证明编码基因是miRNA的靶基因：荧光素酶报告实验 总之，ceRNA属于三元直接作用机制研究中相对较易操作（需要做的难度稍大的实验只有RIP）也较易理解（分子调控机制较为模板化）的一种，希望通过本篇文章的解读，大家对体系课酸菜校长亲授的知识（详见第21策《蝶使蜂媒》）能有更直观的感受，更深一点的理解，并且早日应用到自己的科研工作中，领略直接作用机制的风采。下次再见！本周，第二十六期文献品谈会，为大家讲解一篇2019年发表在【oncogene】，影响因子为 7.971，文章主要包括细胞、动物、临床三个维度。
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