基迪奥客户文章：lncRNA医学研究常用套路

发表期刊：《MolecularTherapy-Nucleic Acids》

影响因子：6.392

合作单位：厦门大学

 

研究目的

研究肝癌增殖和转移相关lncRNA和其功能机制。

研究思路

研究结果

1

表达谱研究

与癌旁组织相比，肝癌组织中发现了差异表达的2,665个lncRNAs和3,885个mRNAs（fold change ≧ 2, p <>

 

 

图1. 肝癌lncRNA表达谱和qPCR验证

2

lncRNA HCAL的筛选

通过共表达分析，作者侧重研究含有高频率肝癌相关的mRNA的子网络。通过这种方式作者筛选到一个基因HCAL，该基因与很多肿瘤相关的mRNA相关，如：STMN1, FOS和IL-3（图2）。

 

 

图2. HCC中差异基因共表达分析（HCAL为中心的子网络）

 

进而作者利用qPCR在84对癌和癌旁中验证HCAL的表达情况，结果显示HCAL在癌症组织中显著上调。并且在LO2和7种HCC细胞系HepG2,PLC/PRF/5, SK-Hep-1, Huh-7, SMMC-7721, MHCC-97h,和HCC-LM3中也发现相同的表达规律。

Recurrence-free和overall survival分析显示HCAL的高表达与低生成率显著相关（图3）。

 

 

图3. HCAL的qPCR定量和生存曲线分析

 

3

In Vitro 和 In Vivo 功能实验

通过CCK-8和colony formation assay表明HCAL敲低显著降低肝癌细胞的增殖。小鼠体内成瘤实验表明HCAL敲低后，肿瘤组织显著小于正常对照（图4）。总之，一系列的体外和体内实验表明HCAL影响了肿瘤细胞的增殖，凋亡，迁移和侵染。

 

图4. HCAL敲低后抑制了肿瘤的发展

4

转录组测序分析

为了更好研究HCAL的靶向基因，作者利用HCAL敲低细胞系SMMC-7721，进行转录组测序。结果发现了204个差异基因（fold change ≧ 2, p < 0.05）。kegg通路研究，发现hcal调节一些癌症相关的通路基因，如：p53,="" cancer,="">

 

 

图 5. HCAL敲低细胞系转录组分析

 

5

ceRNA预测和验证

作者首先利用生物信息学方法预测HCAL的ceRNA网络，锁定靶向mRNA LAPTM4B作为研究对象，因为LAPTM4B在多种癌症中的重要作用。此外，HCAL序列与LAPTM4B 的3＇UTR区域存在96%相似度，也暗示着HCAL与LAPTM4B存在ceRNA调控关系。

HCAL敲低后，LAPTM4B的mRNA和蛋白水平也显著下降；在84对癌症样本中进行qPCR验证，也发现LAPTM4B和mRNA呈现显著正相关。总之，一系列的预测和功能实验表明LAPTM4B是HCAL的靶基因。

 

图6. HCAL与LAPTM4B表达呈正相关

 

接着，作者研究HCAL结合miRNA调控LAPTM4B的机制。先通过TargetScan预测HCAL的结合的miRNA，通过RIP assays进行验证；利用qPCR验证25个与肝癌发生和发展相关的miRNAs；HCAL immunoprecipitates实验显著富集了miR-15a，miR-155, miR-196b, miR-196a, miR-300和miR-135a；最后再通过报告基因进行验证。

 

 

图7. 功能验证HCAL的ceRNA机制

 

总   结

① 这是一篇比较常规和完整的医学非编码RNA的研究文章，首先筛选出目标lncRNA，确定其癌症相关生物学功能；

 

② 再通过生信预测和建立敲低模型测序来研究它的靶基因和网络调控机制，筛选出靶向mRNA，并用实验进行验证；

 

③ 最后，通过生信预测和实验研究lncRNA结合的miRNA，最终阐明lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控机制。

今天的内容就到这里啦~

拓展阅读

《文献解读| lncRNA参与功能机制研究的典型思路》

《Cell子刊首次报道lncRNA编码小肽抑制癌症》

《lncRNA编码蛋白的新议题》