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自2012年首次确认circRNA是一类由 mRNA 前体经反向可变剪切而来的共价闭合且保守的单链转录本后，越来越多的研究证实 circRNA 是一个古老且保守、具有调控功能的细胞转录产物，能够通过miRNA 海绵功能等方式参与转录后调控。 本篇文献分享将借助发表在Cell Res. (if ~15.393)上的一文展开circRNA与miRNA的关系。文献的题目为 A circular twist on microRNA regulation。 简单circRNA的研究过程 环形分子在上世界70年代，在植物病毒的研究中首次被观察到。1993年时，Cocquerelle等人在人类细胞的 ets-1 基因中发现了两个非聚腺苷酸化的环状亚型。同年，Capel等人发现了一个来源于Sry基因的circRNA。而后，随着测序技术及生物信息学的发展，人们发现circRNA是一类由mRNA前体反向剪切形成且大量存在的非编码RNA。 非编码 RNA (non-coding RNA)的简单介绍 非编码RNA是一类能够直接发挥催化和调控功能的转录本，包含miRNA、lncRNA、circRNA等，占真核细胞总RNA的95%以上。其中，miRNA是一类长度约为 21 nt的非编码 RNA，主要通过引导效应蛋白AGO(Argonaute) 通过结合3‘-UTR的种子区抑止编码mRNA的表达。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类转录长度大于200nt，且不编码蛋白翻译的线性RNA，能够通过竞争胞内miRNA，作为海绵一样缓冲并削减其靶基因的表达。而circRNA也具有类似于lncRNAs的性质，并能作为“miRNA-sponges”发挥功能。 内源竞争性(competing endogenous) RNA假设 不同的RNA能够通过MRE (miRNA recognition elements)通过竞争结合miRNA互相联系及相互调节，且特定的miRNA能够包含多个MREs来增加调控的复杂程度，lncRNA和circRNA都属于其中。 ceRNA实例：Cdr1as的发现及实验验证 目前已有多个实验预测且证实，circRNA作为一种内源性竞争RNA可以通过MREs竞争miRNAs，比如Cdr1as包含～70个保守的miR-7结合位点及一个miR-671结合位点。介于两者与Cdr1as序列互补方式的不同，miR-671能够触发Cdr1as的降解，间接影响miR-7的水平。 1.
Morpholino通过在斑马鱼胚胎中注射CDR1as表达质粒的方式敲低体内miR-7，随后又通过注射miR-7前体来恢复表型。 2.
类似的，在HeLa细胞中，Cdr1as能够抑制miR-7。 3.
在结直肠癌和肝细胞癌细胞系中，通过shRNA和siRNA来敲低靶向Cdr1as，导致miR-7水平增加和miR-7靶标下调，抑制肿瘤增殖。 4. Piwecka等人首次通过circRNA完整序列删除的方式获得KO小鼠模型，用于Cdr1as的ceRNA调控网络研究。KO小鼠能够正常存活且没有严重的异常。随后作者根据先通过miRNA-AGO2复合物能够与其靶RNA形成嵌合体（chimeric）的特点设计CLIP-seq分析获得数据，通过嵌合体分析流程及评分标准，在体内证实Cdr1as与miR-7和miR-671之间的直接相互作用。其次对四个高水平表达Cdr1as脑区域进行miRNA测序，以比较KO小鼠与野生型间miR-7和miR-671表达水平的差异，惊奇地发现miR-7在大脑中明显下调，而其靶基因特异性上调。这与之前的报道中ceRNA的调控模式并不一致。那么如何解释这个相反的结果呢？作者提出理解这些不同转录组之间平衡的关键是Cdr1as-miR-7结合位点结构。Cdr1as上的miR-7 MRE缺乏种子区域之外的互补性，阻止AGO2介导的剪切。因此，Cdr1as与其他转录物竞争性结合miR-7，但并不抑制miR-7。相反，miR-671结合位点与Cdr1as显示出完美的互补性，因此在KO小鼠中，miR671的水平增加。正如在siRNA介导的研究中，急性靶向Cdr1as释放稳定的miR-7:AGO2复合物，其能够快速结合并作用作用于其他miR-7靶位点，导致他们在短期内抑止。另一方面，在细胞质中长时间的缺少Cdr1as，则会降低miR-7的水平（图1）。  展望 AGO2介导的ceRNA网络调节在microRNA发挥调控功能过程中的机制需要进一步的研究，预测靶向特定ceRNA时需考虑其可能导致伴随的抑制多种其他RNA，或者共享相同miRNA的MRE。circRNA在发挥海绵功能时需要考虑其竞争性而不止抑制性海绵。
值得注意的是，异常的circRNAs在癌症中也被鉴定为染色体易位的原癌基因产物。circRNA 在体内的与多个癌症相关联，在基因表达层面，Cdr1as的急性与慢性靶向过程可能对治疗具有积极意义。
虽然Piwecka 等利用CRISPR / Cas9方法并去除了整个Cdr1as基因座（2.9 kb）并通过表型和miR-7配偶体验证了其特异表达Cdr1as，但是由于circRNA的形成方式大多都是与反向剪切过程得来的，因此使用该策略可能伴随着蛋白质编码外显子或lincRNA /假基因的缺失，亟需体内删除、诱变的替代方法。 |
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