1）linc1281在mESC中表达丰度高；而在分化后的细胞中表达量低； 2）FISH实验（下图左）及细胞浆/细胞核PCR（下图右）表明linc1281主要分布于细胞浆； 3）敲低linc1281并不会影响mESC的自我更新，但是会影响mESC的分化。
1）MeRIP-PCR实验证明，m6A抗体富集的RNA片段中有丰富的linc1281（下图左）； 2）敲低Mettl3（Mettl3:m6A甲基化修饰酶）显著降低linc1281的甲基化修饰（下图中），但不影响linc1281的表达（下图右）；
1）在linc1281最后一个外显子上发现3个m6A motif（RRACU），为潜在的m6A修饰位点（下图）； 2）构建linc1281 motif 腺嘌呤突变（点突变：A-G/A-T或A缺失突变）的病毒载体，转染入HEK293FT细胞，结果发现在motif腺嘌呤突变的几组细胞中，m6A水平显著下降，表明linc1281的m6A修饰主要就是发生在这几个motif位置； 3）为了研究m6A修饰对linc1281表达和功能的影响，在linc1281敲低细胞（记为sh1281）中过表达野生型linc1281（记为sh1281+linc1281）、motif中心位置A-G突变的linc1281 (记为sh1281+A-G)和motif其他位置A突变的linc1281(记为NC，motif中心位置的A依然保留)，PCR显示各类型细胞中linc1281的表达丰度均恢复，且表达丰度无显著差异；另外，sh1281+linc1281和sh1281+NC恢复了促进胚胎干细胞分化的能力，而sh1281+A-G仅恢复了有限的分化能力。综合这些结果，研究者认为，linc1281的表达丰度并不是表型变化的影响因素，而充足的m6A修饰对于linc1281调控mESC分化是必须的。
因lincRNA主要分布于细胞浆中，因此作者认为linc1281很可能是一类ceRNA，发挥转录后调控作用。 1）预测linc1281可能结合的miRNA，研究者发现let-7家族的很多miRNA能和linc1281直接结合。鉴于已有研究表明let-7/Lin28在干细胞干性中的重要作用，研究者将目标锁定在linc1281-let-7/Lin28通路上； 2）荧光素酶报告实验(下图左)和RIP实验（下图中和右）表明，linc1281和let-7 miRNAs间有直接的结合作用（与control比较，荧光信号强度显著下降）。同时在linc1281敲低和敲除的细胞中，let-7的表达量显著上升，这种负相关也符合ceRNA机制中表达负调控关系。此外，随着let-7表达量提升，let-7靶基因Lin28蛋白表达量显著降低。综合以上，linc1281竞争性结合let-7，发挥ceRNA作用。
为了研究m6A修饰对于linc1281结合let-7的影响，作者进行了如下实验： 1）在linc1281敲低的细胞(sh1281)中，过表达野生型linc1281(记为sh1281+linc1281)、A-G突变linc1281(记为sh1281+A-G)和非motif中心位置A突变的1281（记为sh1281+NC，motif中心位置的A依然保留），PCR结果显示各组细胞中linc1281表达量无差异，let-7的表达量在sh1281+linc128和sh1281+NC显著下降，而在sh1281+A-G中let-7表达量较高，研究者认为可能是A-G突变导致的不足量的m6A修饰导致了这一结果，研究者认为m6A修饰可能直接参与了linc1281和let-7的互作。 2）作者又研究了甲基化修饰酶对于linc1281与let-7结合的影响：在Mettl3敲低的mESC细胞(记为shMettl3)和对照细胞(记为shcontrol)中，共转入linc1281报告基因和miRNA mimics（control mimics或let-7 miRNAs mimics）。在shcontrol组，共转入linc1281报告基因和let-7 miRNAs mimics细胞的荧光信号强度显著下降（下图左）；而在shMettl3组中，荧光信号强度未有显著差异（下图右）。结果说明Mettl3对于let-7结合linc1281是至关重要的。 补救实验：作者在shMettl3 mESC细胞中过表达野生型Mettl3或催化活性灭活的突变型Mettl3(下图左)，然后检测linc1281的m6A水平，结果发现过表达野生型Mettl3的细胞，linc1281的m6A修饰水平得以补救，而过表达突变型Mettl3的细胞中，linc1281的m6A水平未发生变化(下图右)。实验说明了，linc1281的m6A甲基化依赖于Mettl3的酶活性。 3）为了排除是因为Mettl3缺失导致的广泛的m6A修饰水平下降而导致的上述结果，作者在野生型NIH/3T3细胞中共转入野生型linc1281或motif中心位置腺嘌呤点突变linc1281（A-T或A-G或A缺失）或motif其他位点突变的linc1281 (记为NC mutant或A916-C，motif中心位置的A依然保留) 的荧光报告载体和let-7 mimics。结果显示，转入野生型linc1281的细胞的荧光信号强度显著下降，而转入腺嘌呤点突变linc1281的细胞的荧光信号未有显著变化，同时在转入motif其他位点突变linc1281的细胞中，荧光信号强度也显著下降。 进一步，在shMettl3和shcontrol细胞中共转入NC mutant+miRNA mimics或A-G点突变linc28+miRNA mimics。结果显示，在shcontrol细胞中，转入NC mutant+miRNA mimics后，因依然存在Mettl3，荧光信号明显减弱；而在shMettl3细胞中，转入不同的linc1281，荧光信号强度并未有明显的差异。 以上所有实验，证实linc1281上的m6A修饰对于其与let-7互作至关重要。
1）linc1281敲低的细胞（记为sh1281）中，let-7表达量升高，lin28的表达量下降； 2）作者建构了人工let-7吸附海绵，并转入sh1281细胞中，结果let-7的表达受到抑制，sh1281 mESC的分化能力得以恢复，证实let-7的确是linc1281的靶分子； 3）为了研究let-7靶蛋白Lin28是否参与了linc1281-let-7通路，作者在sh1281细胞中过表达Lin28a或Lin28b，然后比较细胞的分化能力的变化，结果发现mESC的表型也得到了补救。 |
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