|
大家好，我是文献菌，今天来学习的是交互嵌套：三元两组交互——转录因子 miRNA 靶基因。这是一篇文章是4 的胰腺癌研究，接下来就让我们一起解构这篇文章吧！
该文章2022年发表在Cancer biology & therapy，题目为《The NF-κB/miR-488/ERBB2 axis modulates pancreatic cancer cell malignancy and tumor growth through cell cycle signaling》，影响因子4.875分，中科院三区。  关键要素疾病：胰腺癌 表型：增殖、凋亡、细胞周期 主变量（miRNA）：miR-488 交互变量：NF-κB（转录因子）、ERBB2（靶基因） 效应变量（蛋白）：ERBB2 套路格式：转录因子 miRNA 靶基因的三元两组交互（转录因子—miRNA启动子，miRNA-靶基因mRNA）（即包含蛋白—DNA与miRNA—mRNA三元两组交互的信号接力模式）
科学假设在【胰腺癌】中，上游交互变量【NF-κB】结合并促进主变量【miR-488】的表达，而主变量【miR-488】通过结合并促进交互变量【ERBB2】降解，从而调控【增殖、凋亡、细胞周期】表型  逻辑关系因果逻辑（1）：【miR-488】调控【增殖、凋亡、细胞周期】表型 因果逻辑（2）：【ERBB2】调控【增殖、凋亡、细胞周期】表型 因果逻辑（3）：【NF-κB】与【miR-488】结合调控了【miR-488】表达 因果逻辑（4）：【miR-488】与【ERBB2】结合调控了【ERBB2】表达
数据解读Fig.1 Selection and verification of miRNAs-related pancreatic cancer carcinoma. 【细胞、组织水平】单变量表达差异，相关性研究
A. 通过对TCGA数据库中胰腺癌miRNA表达数据进行差异分析，获得差异表达基因；再通过相关性分析，获得与胰腺癌T分期相关的miRNA，然后取两者交集，筛得主变量miR-488（表达差异，生信分析）。 B. 通过最佳截止值将来自 TCGA数据库的胰腺癌患者分为高和低 miR-488表达组，然后运用Kaplan-Meier法进行生存分析，发现生存率率随着miR-488表达的增加而增加（生存预后分析）。 C. 同理进行Cox回归分析，发现较高的miR-488表达与较好的总生存期相关（生存预后分析）。 D-F. 利用TCGA数据，进行临床相关性分析，发现miR-488在晚期Tstages、晚期 Nstage和晚期TNM阶段的患者中低表达（临床相关性分析）。 G. miR-488在四种胰腺癌细胞中显著低表达（表达差异，细胞水平）。 H. miR-488在胰腺肿瘤组织样本中显著低表达（表达差异，组织水平）。 结论：主变量 miR-488在胰腺癌中表达比正常低，与胰腺癌的预后正相关，提示可能是一个抑癌基因。 Fig.2 Specific effects of miR-488 on pancreatic cancer cell phenotypes. 【细胞水平】一正一反单变量论证，miR-488抑制细胞周期和增殖，促进凋亡表型
A. 验证miR-488过表达和敲减的转染效率（一正一反）。 B-D. 应用CCK-8法测定的细胞活力、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期，发现miR-488过表达显著抑制细胞活力，增强细胞凋亡，并引起细胞周期 G2/M 期停滞（细胞水平，一正一反操作，细胞周期、增殖、凋亡表型）。 E.WB检测细胞周期相关蛋白的表达，发现miR-488过表达降低了cyclin A、cyclin B、CDK1和CDK2蛋白的含量，而miR-488敲减增加了这些蛋白的含量（分子水平，一正一反操作，细胞周期表型）。 结论：miR-488负调控胰腺癌细胞的细胞周期和增殖，正调控凋亡。 Fig.3 Specific effects of miR-488 on pancreatic cancer growth. 【动物水平】一正一反单变量论证，miR-488抑制细胞周期和增殖
ACD.miR-488过表达显著降低了肿瘤的体积和重量，而miR-488敲低则增加了肿瘤的生长（组织器官水平，一正一反操作，增殖表型）。 B.实时荧光定量PCR验证感染效率（一正一反）。 E.通过WB检测细胞周期相关蛋白的表达，发现携带过表达miR-488的PANC-1细胞衍生肿瘤的小鼠肿瘤组织中，Ki-67、PCNA、cyclin A、cyclin B、CDK1和CDK2 的蛋白水平也显著降低，而miR-488敲低显示出相反的结果（分子水平，一正一反操作，细胞周期表型）。 结论：miR-488可在体内抑制胰腺癌细胞周期和增殖表型。 Fig.4 Selection and verification of potential downstream targets of miR-488 . 【分子水平】分子交互及一正一反调控关系论证，miR-488通过交互调控ERBB2表达
A. 利用在线工具miRDIP预测miR-488的潜在下游靶基因，并对其靶基因进行KEGG富集分析，发现靶基因显著富集于细胞周期因子，与细胞分裂相关（功能富集分析）。 B. 对GSE32688 进行miR-488共表达分析，并对miR-488的共表达基因进行GSEA富集分析，发现这些基因在细胞周期调节（G2M检查点）中显著富集（功能富集分析）。 C. 对miR-488与共表达基因进行相关性分析，发现miR-488与ERBB2表达呈显著负相关（相关性分析，筛选交互靶点）。 D-E. ERBB2在胰腺癌组织中的表达明显高于正常对照组织中的表达，且与 miR-488表达呈负相关（组织水平，差异表达，相关性验证）。 F. miR-488过表达显著下调ERBB2的表达，而miR-488敲减上调ERBB2的表达（mRNA水平，一正一反调控关系论证）。 G. WB也得到了与F一致的结果（蛋白水平，一正一反调控关系论证）。 H. 构建ERBB2野生型和突变型载体，与miR-488模拟物或抑制剂共转染到 PANC-1细胞中，应用荧光素酶报告基因测定发现，野生型ERBB2载体的荧光素酶活性通过miR-488的过表达被线显著抑制，而通过miR-488的抑制被增强。突变型ERBB2载体可消除其荧光素酶活性的变化（分子交互）。 结论：miR-488通过靶向ERBB2 mRNA3'UTR来抑制 ERBB2的表达 Fig.5 Specific effects of ERBB2 on pancreatic cancer cell phenotype. 【细胞水平】单变量论证，ERBB2调控细胞周期、增殖和凋亡表型
A. qPCR验证敲减ERBB2的转染效率。 B-D.与miR-488过表达类似，ERBB2敲低可抑制细胞活力、促进细胞凋亡和引起细胞周期G2/M期停滞（细胞水平，反向操作，细胞周期、增殖、凋亡表型）。 E.ERBB2敲低降低了两种胰腺肿瘤细胞中的生长相关蛋白cyclin A、cyclin B、CDK1和CDK2的表达（分子水平，反向操作，细胞周期表型）。 结论：ERBB2可促进胰腺肿瘤细胞的细胞周期和增殖，抑制凋亡。 Fig.6 miR-488 modulates pancreatic cancer cell phenotype through ERBB2. 【细胞水平】回复论证，双向操作，miR-488依赖ERBB2调控细胞周期表型
A. 抑制miR-488上调了ERBB2的表达，ERBB2敲低下调ERBB2表达；而ERBB2 敲低显著逆转了抑制miR-488对ERBB2表达水平的影响。 C-D.抑制miR-488可促进细胞活力、抑制细胞凋亡，并且不会导致细胞周期停滞；ERBB2敲低可抑制细胞活力，增强细胞凋亡，并引起细胞周期G2/M期停滞；而ERBB2敲低显著减弱了抑制miR-488对细胞生长的促进作用，说明miR-488依赖ERBB2调控生长表型（反反反，细胞周期、增殖、凋亡表型）。 E. 抑制miR-488上调了细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin B、CDK1和CDK2的表达，ERBB2敲低下调其表达；而ERBB2敲低显著逆转了抑制miR-488对细胞周期相关蛋白的上调作用，说明miR-488依赖ERBB2调控细胞周期表型（反反反，细胞周期表型）。 结论：在体外，miR-488依赖ERBB2调控细胞周期、增殖、凋亡表型表型。 Fig.7 Specific effects of miR-488 and ERBB2 on pancreatic cancer growth. 【动物水平】回复实验，miR-488依赖于ERBB2调控胰腺肿瘤细胞细胞周期、增殖表型
ACDE. 过表达miR-488显著逆转了过表达ERBB2对肿瘤生长和细胞周期相关蛋白表达促进作用，说明miR-488依赖ERBB2调控肿瘤生长表型（反正正，细胞周期、增殖表型）。 B. qPCR验证裸鼠移植肿瘤模型。 结论：在体内，miR-488依赖ERBB2调控细胞周期、增殖表型。 Fig. 8 NF-κB transcriptionally inhibits miR-488 expression to affect its function. 【分子水平】分子交互及回复论证
A. IL-1β或TNF-α处理显著抑制miR-488的表达。 B. ChIP实验表明，与IgG组相比，NFκB免疫沉淀物中含有结合位点的 miR-488启动子片段的水平显著增高（分子交互）。 C. 荧光素酶报告基因测定表明，miR-488野生型载体的荧光素酶活性被pcDNA3.1-NF-κB显著抑制，而突变型消除了荧光素酶活性的改变（交互位点验证）。 D-F. 抑制miR-488增强胰腺癌细胞活性，抑制其凋亡，不导致细胞周期停滞，使用NF-κB抑制剂SN50后，减弱胰腺癌细胞活性，促进其凋亡，导致细胞周期停滞；而SN50对细胞生长的抑制作用可被抑制miR-488后逆转，说明NF-κB依赖miR-488调控胰腺癌细胞的细胞周期、增殖和凋亡表型（正反正，细胞周期、增殖、凋亡表型）。 G.抑制miR-488上调了细胞周期蛋白cyclin A、cyclin B、CDK1和CDK2的表达；使用NF-κB抑制剂SN50后，降低细胞周期蛋白的含量；同样，抑制miR-488显著减弱了SN50对细胞周期蛋白的下调作用，说明NF-κB依赖miR-488调控胰腺癌细胞生长表型（正反正，细胞周期表型）。 结论：NF-κB依赖miR-488调控胰腺癌细胞的细胞周期、增殖和凋亡表型。
论证规范1. 单变量论证（表达差异，一正一反，细胞动物） （1）筛猜主变量（图1A） （2）miR-488表达差异（图1A、G、H） （3）miR-488临床相关性（图1B-F） （4）主变量miR-488调节胰腺癌细胞生长表型的细胞实验（正 反）（图2） （5）主变量miR-488调节胰腺癌细胞生长表型的动物实验（正 反）（图3） （6）交互变量ERBB2调节胰腺癌细胞生长表型的细胞实验（反）（图5） 2. 调控关系论证（两两调控，三三回复） （1）主变量miR-488调控ERBB2表达（图4） 关键调控：负调节ERBB2（图4F-G）
（4）上游交互变量NF-κB依赖于主变量miR-488的回复验证细胞实验（图8D-G） 3. 交互作用论证（双向互作，位点验证） （1）主变量miR-488与交互变量ERBB2的互作及结合位点验证（图4H） （2）主变量miR-488与上游交互变量NF-κB的单项互作及结合位点验证（图8BC） （3）突变体的交互必要性论证（图4H、图8C）
套路归纳1. 本文优点：分子、细胞、动物、生信多维度论证，一正一反双操作，多表型平行嵌套，增加论证的广度和深度，值得借鉴。 2. 本文缺点：分子交互中，做了突变位点但是没有用突变体进行表型和调控关系的必要性论证。NF-κB依赖miR-488调控胰腺癌细胞生长表型的回复论证，没有在动物模型上进行重复验证。  END |
|
|
