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想必大家都要做实验课题设计，例如在写开题或者标书的时候，也就是计划要在接下来要做的实验，咱们上一期给大家介绍了lncRNA的研究是如何规划课题设计的，讲解了一篇10分文章的lncRNA文章研究套路。 今天咱们来讲一讲万金油miRNA的技术路线设计套路，不要只知道荧光素酶报告实验哦。
一般来讲，咱们研究miRNA的功能和机制都是关注其降解调控靶基因mRNA的丰度水平的，例如miR-X靶向调控Y基因的mRNA水平，有哪些技术路线呢？ （1）确定配对关系 最基本的就是调控关系是这种碱基配对序列，你在targetscan、miRanda等网站上预测的miRNAs多达上百个，需要进一步验证他们的匹配性和作用位点。 选打分高的miRNA （2）确定表达负相关性 那么miRNA和mRNA的表达水平肯定是负相关的，就是miRNA↑→mRNA↓，miRNA↓→mRNA↑，这里需要给一张图用来证明。 miRNA和mRNA的关系是这样的。
可以到数据库上去预测配对关系、下载。
或者自己检测样本或者细胞中两者表达情况绘制关系图
（3）细胞实验：miR-X对靶基因呈现梯度抑制现象 体外细胞实验咱们用到miRNA mimics，这是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。
Mimics和miRNA inhibitors示意图 最经典的验证方式还是检测时间依赖和浓度依赖，一般采取浓度依赖检测就足以。 设置了mimics的浓度梯度之后，可以做WB验证蛋白的表达水平，也可以直接做Q-PCR验证mRNA水平。
这一步的实验设计是为了证明miR-X对于Y的上下游调控关系以及表达负相关性，以及确定miRNA mimics的最佳使用浓度。
（4）miR-X对靶基因mRNA调控的物理结合验证 这一步呢要使用RIP和RNA-pulldown，但是感觉好贵呢，小小的miRNA实验都要花这么多钱，如果有钱呢，就设计进去，钱不多就省略掉好了，反正后面还有其他实验可以支撑。
用RISC复合物的抗体做RIP，以及RNA pulldown，拿到纯化的RNA做个Q-PCR 这样可以验证物理上miRNA和mRNA是结合的。 但是功能表达互作怎么验证呢？luciferase reporter assay！！！！
（5）miR-X对靶基因mRNA调控的功能性验证 这里的就是用荧光素酶报告实验（luciferase reporter assay） 在荧光素酶报告基因载体的报告基因编码区的下游插入ncRNA或者mRNA的3’UTR区，然后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，通过检测荧光素酶的表达情况以分析ncRNA或者mRNA的3’UTR区中是否含有miRNA的靶位点。同理任意两种RNA-RNA互作都可以利用这个原理。 把靶标基因的3’ UTR克隆到luciferase载体上，荧光强度与miRNA mimics的浓度成反比
（6）seed region序列的阻断实验：anti-miR、3'UTR突变 前面讲的实验都是基于miRNA和mRNA的互补结合序列，那么接下来可以设计阻断实验进行验证其互作，阻断实验有两种： ①阻断miRNA的结合 这里用到miRNA的inhibitors，例如miR-X的反义RNA寡聚物anti-miR，其能阻断miR-X RISC复合物对靶基因mRNA的降解。
阻断miR后，基因的表达不再被抑制 ②突变mRNA的3’ UTR的seed region 就是制作mRNA 3’ UTR的seed region的突变株，或者构建靶基因过表达载体，将3’ UTR的seed region突变，使得miR-X无法结合。
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