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做了 5 年的 MTT 实验 ，耗费了上万块 96 孔板。有成功的喜悦，有失败的沮丧，有好多话要对各位实验同仁说。在这之前，我们先回顾一下 MTT 的原理及操作步骤。 实验原理 MTT 是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下，生成蓝色的 formazan 结晶。formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原，无法形成结晶），且该结晶溶解于 DMSO。利用酶标仪测定波长 490 nm 处的光密度 OD 值，以反映出活细胞数目。 实验步骤 1. 接种细胞：用含 10% 胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到 96 孔板，每孔体积 180 ul。 2. 培养细胞：同一般培养条件，可根据试验目的和要求决定培养时间。 3. 呈色：每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 缓冲液 pH=7.4 配制）20 ul。继续孵育 4 小时，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，对于悬浮细胞，需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。 4. 比色：选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 个人心得体会 1. 细胞消化、接种数量：注意消化和数量，消化和数量，消化和数量（重要的事情说三遍）。从我个人的实验经验来看，这是重中之重。 若消化出现问题，则会影响细胞的活性，进而影响 OD 值。对于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的细胞，消化时胰蛋白酶中不添加 EDTA，消化时也仅需胰酶浸润数秒即可。 然而，对于 SW480 等一系列难以消化的细胞，胰蛋白酶中需添加浓度为 0.25% 的 EDTA。对于细胞接种数量要适宜，过小或过大均会影响 OD 值（过小细胞容易死亡，过大细胞容易生长拥挤）。 我做过的几种常见细胞的每孔接种数量如下（个人经验）： 2. 培养液的弃去及 DMSO 溶解：一般大家喜欢用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。我喜欢将 96 孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。两种方法效果差不多，大家根据个人喜好选择。 加入 DMSO 溶解后，我喜欢将加入 DMSO 的 96 孔板放入 37 ℃ 孵箱内孵育 10～20 min，这样有助于 DMSO 对紫色结晶物的溶解（尤其在冬天）。 以下是我在去年 12 月的一些结果（某种药物的细胞毒性实验，绿色为 control 组，红色为加药组）。下图结果显示，若不 37 ℃ 孵育，紫色结晶溶解不充分，造成 OD 值偏小（细胞毒性实验时，control 组的 OD 值最佳范围为 0.5-0.7）。 加入 DMSO 后，37 ℃ 孵育 15 min，振荡 10 min。 无孵育，加入 DMSO 后振荡 10 min。 以上是我这几年 MTT 实验的心得，与大家分享。祝愿大家实验顺利，早发文章。 作者：陈旭 |
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