简介 细胞毒性是指由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件,不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。 常用细胞毒性检测方法有CCK-8法、MMT法、LDH法。 1、与MTT法相比: 1)CCK-8使用更为方便,无需洗涤细胞; 2、与LDH法相比: 1)CCK-8是加在细胞中,而LDH检测是细胞上清,这样细胞还可以用来做其他实验;
原理 以CCK-8法为例简述其原理:CCK-8试剂盒中含水溶性四唑盐WST-8 (化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),WST-8在电子载体1-Methoxy PMS存在的条件下,活细胞线粒体中的脱氢酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黄色甲瓒燃料,而甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系。 用途 1、药物筛选实验; 材料与仪器 【材料】细胞悬液,化合物溶液、CCK8试剂、完全培养基、PBS、0.25%Trypsin-EDTA 【仪器,耗材】96孔板,二氧化碳培养箱,检测波长450-490nm酶标仪 步骤 1、根据具体细胞类型确定其在 96 孔板种植密度,以对照组细胞密度至检测时达到 70%-90%为参照,每组设置 3-6 个复孔,孔板边缘空不用,加入与培养基等体积的无菌 PBS 溶液; 2. 每孔加入培养基体积 1/10的CCK-8 溶液。若起始的培养体积为 200 微升,则需加入 20 微升 CCK-8 溶液,其它情况以此类推。同时以加了相同体积细胞培养液和 CCK-8 溶液但没有细胞的孔作为空白对照。若所用药物会干扰检测结果,则选加入等体积细胞培养液、药物和CCK-8溶液但无细胞的孔作为空白对照(注意不可产生气泡); 3. 在细胞培养箱内继续孵育 2-4 小时,建议选取2、3、4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验; 4. 在 450 nm测定吸光度。如无 450 nm滤光片,可以使用 420-480 nm的滤光片。可以使用大于 600 nm的波长,例如 650 nm,作为参考波长进行双波长测定。 注意事项 1、本实验使用96孔板进行检测,周围一圈最容易蒸发,检测会因体积不准确而增加误差故弃用周围一圈,加入等体积相同量的PBS、水或培养液; 2、本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,因而还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。 3、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定; 4、酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去; 5、试剂有一定的毒性,请穿好实验服并戴一次性手套操作; 6、试剂要注意避光4oC或-20oC保存; 常见问题 1. 如果细胞生长较慢,且细胞较小,可以最大接种1x10^4 cells/well,但加入化合物后处理时间最长为72 h。 2. 化合物如果难溶于水,可以在培养基中适当添加DMSO、DMF以助溶,但最大浓度不宜超过0.5%,因为DMSO和DMF对细胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、DMF助溶,需保证其他浓度的化合物DMSO、DMF的浓度也相同。 3.若吸光度值太低,怎么办法? |
|