细胞毒性、增值检测（CCK-8 法）

一、CCK-8 简介

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)：一种基于 WST-8 用于细胞增殖和细胞毒性检测的试剂盒。

用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

CCK-8 试剂中含有 WST-8 【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于 MTT 的的化合物，它在电子耦合试剂 1-Methoxy PMS 存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物 Formazan，生成的 Formazan 数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

常用毒性/增殖试剂比较如下：

检测方法	MTT	XTT	WST-1	CCK-8
甲瓒产物的水溶性	差(需要加有机溶剂溶解)	好	好	好
检测灵敏度	高	很高	很高	很高
检测时间	较长	较短	较短	最短
检测波长	560-600 nm	420-480 nm	420-480 nm	430-490 nm
细胞毒性	高，细胞形态完全消失	很低，细胞形态不变	很低，细胞形态不变	很低，细胞形态不变
试剂稳定性	一般	较差	一般	很好
批量样品检测	可以	非常适合	非常适合	非常适合
便捷程度	一般	便捷	便捷	非常便捷

二、操作步骤

1 制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1）制备细胞悬液：细胞计数。

2）接种到 96 孔板中：按比例（例如 1/2 比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个重复孔。每孔约 100 μL 细胞悬液。

3）37℃ 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 h， 如果不需要贴壁， 这步可以省去。

4）每孔加入 10 μL CCK-8 增强型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂粘在孔壁带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡，以免影响吸光度的检测。

5）培养箱内孵育一定时间后测定 450 nm 吸光度，制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴），吸光度为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间。）

2 细胞活性检测

1）制备细胞悬液：细胞计数。

2）接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔加入 10 μL 细胞悬液，可设置 3 个重复孔。

3）37℃ 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要 2-4 h，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4）每孔加入 10 μL CCK-8 增强型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂粘在孔壁带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。注意不要形成气泡，以免影响光度的检测。

5）培养箱内孵育 0.5-4 h：细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，对于大多数情况孵育 1 h 即可。如果显色不够的话，可以继续培养，以确定最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 h）。

6）测定 450 nm 吸光度：如果暂时不测定吸光度，可以向每孔中加入 10 μL CCK-8 反应终止液，遮盖培养板避光保存在 2-8℃， 在 7 天内吸光度不会发生变化；或者可以向每孔加入 10 μL 自己配置的 0.1 M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，在 20 h 内吸光度不会发生变化。

3 细胞增殖-毒性检测

1）制备细胞悬液：细胞计数。

2）接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约 100 μL 细胞悬液，可设置 3 个重复孔。

3）37℃ 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 h，如果不需要贴壁，这步可以省去。也可以根据实验要求的不同，培养相应的时间。

4）每孔加入 0-10 μL 不同浓度的待测药物。

5）37℃ 培养箱中培养：加入待测药物的培养时间，要看该物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。

6）每孔加入 10 μL CCK-8 增强型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂粘在孔壁带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡，以免影响吸光度的检测。

（注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可以加 CCK-8 之前除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基，以去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。）

7）培养箱内孵育 0.5-4 h：细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，对于大多数情况孵育 1 h 即可。如果显色不够的话，可以继续培养，以确定最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 h）。

8）测定 450 nm 吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490 nm，参比波长 600-650 nm。如果暂时不测定吸光度，可以向每孔中加入 10 μL CCK-8 反应终止液，遮盖培养板避光保存在 2-8℃， 在 7 天内吸光度不会发生变化；或者可以向每孔加入 10 μL 自己配置的 0.1 M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，在 20 h 内吸光度不会发生变化。

4 计算公式

细胞存活率 = [ (As - Ab) / (Ac - Ab) ] × 100%

细胞存活率 = [ (Ac - As) / (Ac - Ab) ] × 100%

As: 实验孔（含有细胞培养基、 CCK-8、 待测药物）的吸光度

Ac: 对照孔（含有细胞培养基、 CCK-8、 没有待测药物）的吸光度

Ab: 空白孔（不含细胞和待测药物的培养基、 CCK-8）的吸光度

5 注意事项

1）建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

2）CCK-8 反应时间的确定：一般情况下，白细胞显色比较困难，因此需要增加细胞数量和延长 CCK-8 反应时间。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色，因此悬浮细胞在加入 CCK-8 培养 0.5-4 h 后，可先从培养箱取出，目测或用酶标仪测定显色程度，若显色困难可以继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞，CCK-8 的培养时间一般为 0.5-4 h，在培养 20 min 左右可以取出肉眼观察显色程度。

3）每孔接种细胞数：当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔（100 μL 培养基）。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

4）设置空白对照：在不含细胞的培养基中加入 CCK-8，培养一定的时间，测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入 CCK-8，培养一定的时间，测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。

5）影响 CCK-8 测定的物质：由于 CCK-8 检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应，所以如果待测体系中存在氧化还原物质则可能会干扰检测结果，还原物质会使吸光度增加，氧化性物质会使吸光度减小，因此应需设法去除这些物质的影响。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除只含有培养基的对照孔中本底吸光度而清除，因此不会对检测结果造成影响。

6）测定波长：如果样品为高浑浊的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长 450 nm，参比波长 600-650 nm。如果没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 检测灵敏度最高。

7）当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为检测孔用。

8）如果细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化，应洗涤细胞更换培养基后再加 CCK-8 检测。

9）CCK-8 保存条件：4℃ 避光保存，一年有效。- 20℃ 保存，两年有效。但反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，因此请将经常使用的试剂保存在4℃。

参考

[1]     Wuhan kerui Biotechnology Co., Ltd.