实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！

今天小编要为大家介绍的是：CCK-8实验的操作步骤和注意事项。

CCK-8，英文全称是Cell Counting Kit-8。CCK-8试剂盒可用于简便而准确的细胞增殖和细胞毒性分析。

实验原理

CCK-8试剂盒中，最主要化学药品是WST-8【化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，能够被细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜染料(Formazan)。

也就是说，活细胞数量越多，生成的甲臜量就越多，相应地颜色也就越深。因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析：细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色则越浅。（对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。）

使用酶标仪在450nm波长处测OD值，可间接性反应活细胞的数量。是一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。

（CCK-8实验原理）

因此，CCK-8实验可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

操作步骤

（一）实验材料及试剂：

酒精灯、移液枪、酶标仪（带有450nm滤光片）、96孔培养板、CO2培养箱、CCK-8、细胞计数板、PBS等。

（二）绘制标准曲线

1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。

2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ：按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度（比如，稀释10倍，100倍......），每组4-6个复孔。

3.绘制标准曲线：接种后培养一定时间待细胞贴壁后，然后每100μL培养基加10μL（10%）CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。

根据此标准曲线可测定出未知样品在条件一致的前提下的细胞数。

标准曲线还有助于确定细胞接种的合适数量以及摸索CCK-8后所需孵育时间。

（三）实验：细胞增殖检测

1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。

2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ：根据合适的铺板细胞数（根据自身的细胞类型而定，以一周能铺满为宜，若为血液细胞密度可适当增大），每孔接种约100ul细胞悬液，每组设置4-6个复孔。

①当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000 个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500 个/孔(100μl培养基)。悬浮细胞由于染色比较困难一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

②当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。为减少误差，最外一圈的孔只加100ul PBS、水或者培养液，不作为测定孔用。

③接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。

3.将培养板置于培养箱中预培养（37℃，5% CO2）12-24小时，使细胞达到指数期（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异）。

4.每孔加入10ul CCK-8试剂

①由于每孔加入CCK-8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议直接配置含10% CCK-8培养基（现用现配）以换液的形式加入。注意加CCK-8试剂时不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。加CCK-8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入CCK-8试剂后轻轻震培养板。

②加CCK-8试剂时间可分别在22h、46h、70h、94h时加入，也可以在24h、48h、72h、96h时再加入。重要的是需保证实验组和对照组在同一时间点进行实验。

③若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8。

5.将培养板置于培养箱内继续培养0.5-4小时

①培养时间因孔中细胞的类型和数量而异，需要自己摸索，因为细胞种类不同，形成Formazan的量也不一样。

②如果显色太浅的话，可以将96孔板置于37℃细胞培养箱中继续培养，可参考标准曲线确定培养时间。

③一般情况下，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（最多 4 h）或增加细胞数量。

④CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。可在0.5h、1.0h、2.0h分别观察培养基的颜色。最佳OD 值控制在1.0左右较合适。

6.使用酶标仪检测450nm波长的吸光度（OD值）。实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。

空白对照的设定：在同体积的完全培养基中加入CCK-8，培养同样的时间，和实验组一起测定450nm的吸光度。

①使用酶标仪检测时记得打开96孔板盖子，需保证板子的表面以及板底是干净的，且每个待测孔内没有气泡，以免干扰实验结果。

②如果结果出现“overflw”则需降低细胞接种密度，如果因实验需要不能减少细胞数时可缩短加入CCK-8后的培养时间。

③如果样品为高浑浊的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。（CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。）

④若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

（四）实验：细胞毒性检测

除了需要对细胞进行待测药物干预外，其他步骤与细胞活性检测基本相同。

1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。

2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔)。

3.将培养板置于培养箱中预培养（37℃，5% CO2）12-24小时，使细胞达到指数期（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异）。

4.吸出各孔培养基，向培养板加入10μL不同浓度的待测药物进行干预。（实验组加入含不同浓度药物的培养基，空白组加入不含药物培养基）

5.将培养板在培养箱（37℃，5% CO2）培养一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时，具体时间一般根据细胞周期来决定）。

6.每孔加入10ul CCK-8试剂。

①在做加药实验时，还应考虑药物的吸收。如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只加CCK-8试剂），如果OD值明显偏高，则说明有反应。

②可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物对实验的影响。

③当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

5.将培养板置于培养箱内继续培养1-4小时：

6.使用酶标仪检测450nm波长的吸光度（OD值）

按公式计算：

细胞活力（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

细胞抑制率（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验组吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)；

Ac: 对照组吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物)；

Ab: 空白组吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物)。

注：细胞活力指细胞增殖活力或细胞毒性活力。

注意事项

• 由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。

• 由于 CCK-8 分析基于活细胞中脱氢酶活性的检测，因此影响活细胞中脱氢酶活性的条件或化学物质可能会导致实际活细胞数与使用 CCK-8 分析确定的细胞数之间存在差异。

• 考虑到不同类型细胞代谢水平存在差异，有些细胞在药物处理后，可能活细胞数不变，但是有氧代谢能力降低后，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少。

• CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。

• 在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

• 金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

• CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰，可以通过减去空白孔中本底的吸光度而消除。

• 混合或重悬组分时，避免产生气泡，因为它们会影响OD值读取。

• 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

• CCK-8反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。

CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。

优点

1、使用方便，CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，可以直接加入到细胞样品中（悬浮和贴壁细胞均适用），不需要预配各种成分，不需要对细胞进行过多的处理，也不必添加放射性同位素、有机溶剂等，且能够快速进行检测；

2、CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；

3、CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；

4、而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；

5、CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；

6、CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。