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细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，通过复制、转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂过程。其中核DNA的复制倍增是整个过程的重要特征。细胞实验中原代细胞和肿瘤细胞株均有增殖能力，为检测研究的药物或者基因的变化对细胞的增殖的影响，一般会使用CCK-8细胞检测、平板克隆实验检测、肿瘤成球实验、EdU染色等实验。
今天跟大家分享下CCK-8细胞活性检测的原理和实验方法、以及一些问题解答。原理： Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。试剂盒中的水溶性四唑盐 WST-8 是 CCK-8 的主要成分，粉色，可以直接加入细胞中，在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜类染料（Formazan），并释放到细胞外溶解在培养基中，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 
应用： CCK-8 法应用非常广泛，主要用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验、活细胞计数、细胞活力检测以及生物因子的活性检测等。 ·适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量 ·不能检测组织中的细胞数量 ·不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要配合其他实验结果进行综合判断 实验步骤：1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；2) 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；3) 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线。 2 细胞活性检测1) 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；2) 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ，将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时，用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。3、细胞活性计算细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%As:实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；Ac:对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；Ab:空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。 1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种合适的细胞数量和加入 CCK-8 试剂后合适的培养时间。 2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。 3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。 4. 建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰 OD 值。 5. 若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。 6. CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。 7. 可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。 8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和 10ul CCK-8 进行检测。 9. 加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。 10. CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。MTT和CCK-8比较 检测方法 | MTT 法 | CCK-8 法 | 甲臜产物的水溶性 | 差（需加有机溶剂DMSO 溶解） | 好 | 适用细胞 | 贴壁 | 贴壁或悬浮 | 产品性状 | 溶液 | 1 瓶溶液 | 使用方法 | 现配现用 | 即开即用 | 检测灵敏度 | 高 | 很高 | 检测时间 | 较长 | 最短 | 检测波长（nm） | 560-600 | 430-490 | 细胞毒性 | 高，细胞形态
完全消失 | 很低，细胞形态不变 | 试剂稳定性 | 较差 | 很好 | 批量样品检测 | 可以 | 非常适合 | 便捷程度 | 一般 | 非常便捷 | 整体性能 | 一般 | 最佳 |
综上，CCK-8法灵敏度高，重复性好，数据可靠，操作简便，省时省力。水溶性，不需要换液，尤其适合悬浮细胞，不需要加放射性同位素或有机溶剂，基本无细胞毒性，不伤害细胞，检测完后的细胞可重复利用。开盖即用，不需要配制。可替代传统的 MTT 法。 但与MTT法相比，CCK-8的价格比较贵。 
CCK-8 法细胞增殖常见问题解答 Q: 一个孔中应接种多少个细胞？
A: 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 ul 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 ul培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先 计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。
Q: 能否用 24 孔或者 384 孔板进行试验？
A: 可以。向各孔中加入培养基体积 10% 的 CCK-8 溶液，如果加入的 CCK-8 体积太少，可以先将 CCK-8 溶液稀释 1 倍制成工作液，然后加入培养基体积 20% 的此工作液。
Q: CCK-8 能否检测细菌细胞？
A: 可以检测 E.coli，但不能检测酵母细胞。向 100 ulE.coli 培养液中加入 10 ul CCK-8 溶液，并培养 1-4 个小时或过夜。
Q: 酚红会影响检测吗？
A: 不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
Q: CCK-8 与胸苷结合检测之间是否有相关性？
A: 有。然而，请注意由于 CCK-8 使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
Q: CCK-8 稳定吗？
A: CCK-8 很稳定，在避光 0-5℃ 条件下至少可以保存 1 年。
Q: 如果没有 450 nm 的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
A: 还可使用 450 nm 到 490 nm 之间的滤光片。
Q: 如何减少由于 CCK-8 试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
A: 可以在加样前用培养基稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。
Q: CCK-8 能否对活细胞进行染色？
A: 不能。因为 CCK-8 的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8)，并通过电子载体将活细胞中的电子交换到培养基中的 WST8 上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此 CCK-8 不能对细胞进行染色。
Q: CCK-8 检测溶液对细胞是否有毒？
A: 加到培养基中的 CCK-8 是没有毒性的，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在 CCK-8 检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者 DNA 荧光检测等。由于每种细胞对于 CCK-8 的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入 CCK-8 培养后的活力。
Q: 在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
A: 有时会有影响。如果药物具有还原性，会和 CCK-8 发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入 CCK-8，测定 450 nm 的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加 CCK-8 )的吸光度高，则证明药物有影响，可在加 CCK-8 之前更换培养基，去掉药物的影响。
Q: 每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
A: 可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。 一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为 CCK-8 沾在壁上而产生误差，建议在加入 CCK-8 后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少，请预先在 1,000～100,000 个/孔范围内摸索条件。
Q: 如何设定空白对照？
A: 在不含细胞的培养基中加入 CCK-8 ，培养一定的时间，测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入 CCK-8，培养一定 的时间，测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。
Q: 在加入 CCK-8 时可否不更换培养基？
A: 一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。
Q: 哪些物质会影响 CCK-8 的测定？
A: 当有还原性物质存在时会影响 CCK-8 的测定，例如含有维生素 C 的 Glucose 等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
Q: 在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
A: 可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。
Q: 在 CCK-8 显色过程中，如何终止反应？
A: 有以下几种方法，以 96 孔板为例： 1、 在显色反应后，将培养板放置 4℃ 冰箱内。 2、 每孔加 10 ul 0.1 M HCL 溶液。 3、 每孔加 10 ul 1%（w/v）的 SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在 24 小时之内测定。
Q: 必须预培养细胞吗？
A: 不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
Q: 如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
A: 金属对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的 lv 化亚铅、lv 铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90% 的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是 10 mM的话，将会 100% 抑制。
Q: CCK-8 试剂的保存条件？
A: 在避光 0-5℃ 条件下可以保存 1 年。
Q: 预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
A: 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
Q: CCK-8 对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
A: 不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入 CCK-8 培养 1-4 小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长 CCK-8 的加入时间或增加细胞数量来解决。
Q: 悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
A: 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
Q: 应该每次做标准曲线吗？
A: 建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
Q: 有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A: 不能。由于 CCK-8 是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
Q: 实验之前，是否需要先检测一下培养基和 CCK-8 是否会反应？
A: 建议使用一个孔作一下检测，因为有的培养基可能含有还原性物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和 CCK-8 是否有反应。一般正常培养基的 OD 值应该在 0.4 以下。 Q&A来源：南京恩晶生物科技有限公司 发论文从来都不是一件简单的事情，还希望每一位奋斗在医学科研前线的同仁们，都能够放松心态正确面对，希望本文能够对大家的科研之路有所帮助。若有任何疑问，都可以联系我们，为您的论文发表保驾护航！
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