|
好多童鞋都在研究lncRNA，指望着能出好文章呢，但是现实是钱少时间赶分数要求高，而有的老师还得赶着明年3月就要申请基金了，一点实验结果都还没呢！ 为什么说lncRNA越来越难做，一方面是机制研究要求高了，另一方面lncRNA研究工具也在不断升级。 nanoCAGE、MERFISH、SHAPE、PAR-CLIP是什么鬼？最近师兄打算尝试一下，就看老板愿不愿意割肉了！ 1） lncRNA文章、基金申请 LncRNA的文章也这么多了，灌水也没那么容易了。 2017年lncRNA相关的基金项目为421个，总资助金额为1.77亿，明年的国自然就得从现在马上准备了。 2）LncRNA研究新、老技术回顾 技术，不管新老，必定是基于lncRNA的作用模式，都知道lncRNA可在转录水平、转录后水平、翻译后水平参与调控，具体的可阅读：国科金写作，lncRNA的机制该怎么设计？ 今天咱们就看看涌现的高逼格新技术，师兄看完是一脸懵逼的。 0.往期经典lncRNA技术回顾 咱们前面有一期文章介绍的非常详细，你都知道？非编码RNA研究技术大盘点。 对RNA-FISH、ChIRP-seq、CLASH、CHART、CLIP-seq、EMSA、RIP技术做了详细的介绍，大家可以看看。 1.首先是找到lncRNA，并预测作用模式 毫无疑问就是作RNA-seq、RNA MicroArray，发现新lncRNA。 没钱做测序或者芯片？没关系，可以靠数据库来完成，利用GEO和TCGA的测序和芯片数据，找到差异的lncRNA。 最后，找到的lncRNA通过ENCODE、FANTOM、Starbase、lncRNAtargets等网站推测该lncRNA的转录、机制模式。（如何预测lncRNA的靶基因？） 新的几个高逼格技术往下看↓ 2.功能验证、定位分析的新技术 研究lncRNA时首先要做功能试验（过表达和敲减），然后是细胞定位（locallization），然后根据预测的作用模式，开展实验，例如与RBP结合等。 ①lncRNA转录抑制：CRISPR/dCas9 最火的基因编辑技术，问题是删除了lncRNA的基因，也会影响相同位置的其他转录本表达，这就比较棘手了。 一个替换的模式是用dCas9，将不具有核酸剪切活性dCas9(deadCas9)与负责转录激活、转录抑制、表观调控和荧光表达等蛋白相融合，可以实现对靶基因的转录水平及表观遗传的调控 ②单分子荧光原位杂交（smFISH） FISH只能定性，而定量版本就是smFISH，它是一种新的基因定量分析方法，能报告转录本丰度和空间定位。 ③MERFISH（multiplexederror-robust fluorescence in situ hybridization） MERFISH是一个高度多重化的smFISH成像方法，可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位，可谓高逼格的FISH技术。 ④nanoCAGE 这种技术实现高通量的lncRNA表达分析以及转录起点的图谱分析，2011年由日本科学家发明。 ⑤PAR-CLIP ( photoactivatable–ribonucleoside- enhanced CLIP) 其依赖了具有光活性的核糖核苷类似物，例如4-硫尿核苷，在活体细胞中将其插入到新生RNA转录本中。在365nm紫外灯辐射的细胞中，光活性的核糖核标记的RNA被诱导与RBP相互作用。RNA随即被转换成cDNA文库并且进行深入测序。 3.lncRNA二级、三级结构分析 lncRNA可以形成特殊的二级和三级结构来执行它们的功能。通过selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-lineprobing来获得局部核苷酸柔性。 SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq。 这么高逼格的技术很花钱，经费有限的话就别考虑了，是土豪的工具，一把辛酸泪啊。 老老实实学生物信息找分子，用普通的FISH和RNAi、WB、Q-PCR发文章吧。 |
|
|
