高分文章和基金是如何用CRISPR/Cas9的？

zhongguorui 2017-08-02

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国自然评审工作结束了，大家静待最终大结局吧，到时候那些没过的童鞋喝几顿酒抽几包烟之后，就可以为明年的国自然以及地方的基金申请开始构思了。

功能实验中分子的过表达、敲减等，最常用的是siRNA、shRNA等，其实新技术的运用也是备受评审专家的青睐的，siRNA和shRNA问题太多，脱靶效应严重，入细胞核困难，所以在新技术的应用上，不妨多花点钱、多花点精力，开始学习CRISPR/CAS9吧，其功能强大不说，例如knockin、knockout之外还有CRISPR/i、CRISPR/a，其可用于基因的功能Screen，晚学不如早学，反正迟早都得接触。

（一）国自然CRISPR这样用，眼前一亮

来看一下往年的CRISPR基金情况，按照2016年趋势，今年的CRISPR项目会突破80项？拭目以待吧。

看看2016年的几个国自然项目标题：

WAS-iPSCs突变基因通过CRISPR/Cas9靶向修复并向造血细胞定向分化研究,235万；
基于光遗传学和CRISPR技术研究组蛋白乙酰化调控Fas表达水平在维持大肠癌干细胞特性中的作用及机制, 17万；
CRISPR/Cas介导的GCPII及III基因联合剔除启动脑损伤后内源性神经保护的研究, 57万；
CRISPR靶向导入SDF-1调控BMSCs促进眼眶骨再生及其机制探讨, 18万；
利用CRISPR技术探索Nrf2抗氧化通路在低氧诱导肺癌转移中的作用及机制, 18.5万；
基于CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术的成年小鼠肝癌模型建立,95万；
CRISPR/Cas9介导的miRNA敲除诱导肺转移中处于休眠状态的肝癌细胞发生再激活的机制研究,17.5万
CRISPR靶向调控HDAC9在骨髓基质干细胞治疗股骨头坏死的作用,51万；
基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除TRIM37泛素化连接酶基因治疗乳腺癌的实验研究, 20万；
CRISPR/dCas9技术介导的联合基因修饰人羊膜上皮细胞治疗糖尿病ED的实验研究,60万；
利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-小型猪动脉粥样硬化模型, 110万；
通过CRISPR-Cas9介导建立可诱导的条件性敲除小鼠模型, 58万；
。。。。。。
Crispr技术的效率高准确度高的特点，使得项目更具创新性。

（二）拿到基金后，CRISPR可以这样玩

今天小编就给大家分享几篇CRISPR/Cas9的文章以及国自然基金，解剖麻雀，给人一种“这样做实验，想发低分都难”的感觉。

CRISPR应用多多，knockin、knockout、CRISPR/i(抑制)、CRISPR/a(激活)，咱们一一讲解。

1. Knockin、knockout：基因敲入、敲除——研究非编码RNA

文章举例：Molecular Cell，IF=14

基因敲入敲除技术是CRISPR应用最广泛的一种应用了，基本原理都是比较类似的，张锋大神最开始的文章也是利用了Knockout技能。

这里分享一篇研究miRNA成熟影响因素的文章。

这篇文章中主要是研究RNA结合蛋白RBP的作用，前期工作中作者筛选得到了大量的RBP可能调控特殊的miRNA成熟，那么作者利用CRISPR技术对RBP进行敲除，检测miRNA的成熟过程是否受到影响，例如作者发现C9ORF114蛋白可以结合在miRNA前体的发夹结构上，作者对C9ORF114进行敲除，操作如下：

根据基因C9ORF114的序列信息设计sgRNA→构建转染载体pX330-gRNA（含Cas9）(Cas9既有识别功能又有DNA切割能力)→lipo3000转染细胞→Q-PCR、WB检测C9ORF114表达情况

2. RNAi沉默不掉lncRNA？Crispr/i可以！

文章举例：NUCLEIC ACIDS RES，IF=10

CRISPR可以实现在不改变基因组的情况下进行表观遗传水平的基因沉默。那为何不用基因敲除呢？

基因的deletion改变了DNA的组成，而siRNA和反义RNA介导的RNA水平沉默，都各有各的不足，而CRISPR/i提高了沉默的效率和精准度，也并没有改变DNA序列，一举两得。

这篇文章探讨的是用CRISPR/i技术表观抑制果蝇的lncRNA转录，从而进行表观遗传学上的调控，转录抑制的步骤如下：

根据基因roX1 和roX2的序列信息设计sgRNA→构建转染载体pGTL-1（含dCas9）(dCas9只有识别功能丧失了DNA切割能力)→转染果蝇和人细胞→Q-PCR检测lncRNA表达情况

有效抑制了lncRNA的表达水平

3. lncRNA过表达的时间想自己说了算？试试Crispr/a！

文章举例：Nature Communications，IF=12

想瞬时过表达感兴趣的目的基因，不需要构建稳转细胞系，下面那可以尝试一下基于dCas9 SAM的激活系统。

这篇文章的研究主题是通过CRISPR/a文库筛选技术寻找可以正向调控AKT蛋白的lncRNA，看看作者如何做的。

PI3K/AKT是细胞信号转导中至关重要的信号通路（个性化信号通路不用愁），活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，比如MDM2/p53, Foxo和NF-kB，进而调节细胞的增殖、转移、血管生成，目前只知道PI3K和PTEN可以调控AKT活性，lncRNA是否调控AKT未知。

本文应用张峰大神发明的CRISPR/Cas9 synergistic activation mediator (SAM)，也即瞬时激活转录技术，作者筛选的步骤如下：

实验目的（筛选正向调控AKT的lncRNA）→跟张锋索要CRISPR/lncRNA激活文库（5sgRNA/lncRNA）→筛选原则确定（凡是能正向调控AKT的lncRNA的细胞株能存活）→筛选机制(AKT高表达导致Foxo蛋白磷酸化后移位降解进而促进嘌呤霉素基因表达)→嘌呤霉素(Puromycin)导致AKT低表达的细胞死亡，AKT高表达的细胞存活→测序存活细胞，目标lncRNA信息获取。