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近几年来，随着测序技术的发展，越来越多的RNA被鉴定出来，其中大部分是长度 > 200 个核苷酸的非编码RNA，定义为长链非编码RNA(Long non-coding RNA , lncRNA)。 与mRNA编码蛋白这一单一功能类分子不同，lncRNA分子功能呈现多样性，核内lncRNA多以顺式调控cis、反式调控trans等方式影响基因表达；而胞浆定位的lncRNA以ceRNA机制为主。 今天我们不谈机制，谈谈大家最关注的—lncRNA功能缺失的手段。 研究基因功能常规操作是功能获得（过表达）以及功能缺失（干扰或敲除），RNAi技术是常用的敲减手段，但该技术针对lncRNA的敲减效果不尽如人意，这极大地阻碍了科研工作者对lncRNA的研究步伐。 我们来看看lncRNA沉默的方法及在应用中的优劣势。  方法一 RNAi RNAi是由双链RNA与Dicer酶形成的沉默复合物（RISC）介导的RNA降解，此方法助推了mRNA的功能研究，但lncRNA-RNAi效果差的原因如下： 1．lncRNA定位于细胞核，而Dicer酶位于细胞质而非细胞核，也就是核定位lncRNA无法用RNAi实现敲减； 2．lncRNA含有复杂的结构，自身形成互补配对，影响靶点结合，导致RNAi无效； 3．lncRNA与其他分子如蛋白质、RNA、DNA等结合，影响靶点结合，导致RNAi无效； …… 所以，针对胞浆定位的lncRNA可以尝试多设计一些靶点尝试；而核定位的则不建议做RNAi。  RNAi 方法二 反义寡核苷酸（ASO） ASO跟siRNA设计原理类似，只是化学成分上有区别。SiRNA是反义RNA，而ASO则是反义RNA、DNA的杂合物，胞浆定位的lncRNA由RNA-RNA形成的二元复合物以RISC的形式被Dicer酶讲解，而核定位lncRNA则形成DNA-RNA复合物被RNase H分解（核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA）。 ASO是多能选手，但是化学合成的ASO只适合常规的细胞学实验，不能做成稳转株进行长期研究，更不适合动物水平的基因功能研究。  ASO结合示意图 方法三 转录抑制（CRISPRi） CRISPRi系统是在DNA水平实现基因的转录抑制，dCas9（失去切割活性的cas9）与转录抑制域KRAB融合，表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区，并通过KRAB抑制PolII与启动子的结合，从而抑制基因的转录。 CRISPRi是在转录前发挥作用，所以不必考虑lncRNA本身的特质，具有较广阔的应用前景。但依然有两方面的限制，一是受限于不同lncRNA的启动子区染色体状况，此种转录抑制并不能做到像RNAi那样的干扰效率，也就是下调程度不稳定；二是需要设计多个靶点并筛选，由此花费较高的成本。 方法四 敲除（KO） 上面介绍的3种方法，都有各自擅长的应用领域，接下来要给大家介绍一个比较全能的方法以及如何应用的？！ 传统的CRISPR/Cas9广泛用于编码基因的敲除，具有DNA切割活性的CAS9搭配gRNA的引导，可完成指定染色体的断裂，编码基因的KO只需要一条设计在编码区的gRNA即可，但lncRNA由于没有像mRNA那样明确的功能区，所以单条靶点的操作不适用。 针对lncRNA的cas9-ko，至少得一对靶点进行区段切除，那么区域的选择就显得至关重要。目前都是在以下区域进行设计的： 1. 针对lncRNA启动子区设计：基因的表达都需要启动子进行转录，缺失启动子也就是失去了转录活性，无法表达; 2. 针对lncRNA本身：双靶点分别设计在lncrna转录起始点和终止处，完成对lncRNA-exon+intron从基因组上的全部去除，达到ko的目的。 为了提升KO效率，小编特定搜罗了CRISPRlnc数据库，收集了来自部分物种的经验证的lncRNA-CRISPR / Cas9 sgRNA，直接查询基因名称即可。 携带双靶点的cas9病毒进入细胞之后进行DNA敲除，但是此法的限制是即便双靶点都有效，并不能直接完成区段的敲除，而可能形成各自区域的错配，达不到敲除的目的，因此验证单个靶点有效性的错配酶法不适用lncRNA的KO验证，KO验证方法如下： 1. 单/双病毒感染细胞，以病毒载体携带的标记基因（荧光、抗性）筛选出混合细胞株；将混合细胞株分离一部分，进行基因组抽提； 2. 针对靶点两端设计一对检测引物，直接扩增步骤1抽提的基因组（PCR延伸时长根据NC中长度设定），然后以凝胶电泳鉴定。由于NC含有目的lncRNA，扩增产物较大或者扩增不出条带（长度超过5k，扩增酶就很难扩增出来），而阳性细胞由于删除的目的lncRNA，扩增产物较小，出现阳性条带就表示有lncRNA-ko的细胞。 3. 若鉴定出阳性条带，将混合细胞分离多皿单细胞培养（培养的皿数根据步骤2阳性条带跟阴性条带的差异而定，如果阳性条带明显强于阴性条带，则分离到阳性细胞的概率就高，反之就低；常规推荐分离20-30皿） 4. 将分离的单细胞重复步骤2，即分离一部分抽提基因组再以相同引物验证，直至能够扩增出阳性片段，而没有阴性产物（或者阴性产物条带较弱为止）。此步验证阳性的细胞即缺失了lncRNA的稳定株。 5. 稳定株可进行QPCR验证以及进行下游功能实验。 CRISPR/Cas9介导的lncRNA-KO最大优势是不受lncRNA本身特征的影响，做到完全敲除的效果；而其风险包含两点：其一是靶点有效性—这点可以通过查询有效靶点或者设计多套靶点以规避风险；其二是后期需要培养单细胞株，单细胞培养时间偏长（时间视细胞类型而定，常规在一个月左右）。 总之，针对lncRNA的下调，根据自己lncRNA的特征，选择合适的操作工具才是王道。对于难敲减的lncRNA，cas9-ko永远是最后的王牌，吉凯基因采取此法帮助多位科研大咖发表了高分文章，快来咨询订购吧！！！ 吉凯CRISPR/Cas9 慢病毒产品体系 
使用吉凯CRISPR/Cas9 慢病毒产品发表的文献 （部 分） 1. Negative feedback–defective PRPS1 mutants drive thiopurine resistance in relapsed childhood ALL，2015,Nature Medicine（IF:28.054），上海交通大学附属儿童医学中心. 吉凯产品：Cas9&RNAi 慢病毒 2. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β /Smad3 pathway.2018, Science Translational Medicine (IF=16.71),南方医科大学. 吉凯产品：CRISPR-Cas9敲除慢病毒
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吉凯产品：shRNA 和 CRISPR/Cas9 慢病毒 5. HMGB1 represses the anti-cancer activity of sunitinib by governing TP53 autophagic degradation via its nucleus-to-cytoplasm transport.2018, Autophagy(IF=11.1), 浙江大学. 吉凯产品：CRISPR/Cas9 慢病毒 6. Long noncoding RNA NEAT1, regulated by the EGFR pathway, contributes to glioblastoma progression through the WNT/β-catenin pathway by scaffolding EZH2,2018,Clinical Cancer Research(IF=10.199),哈尔滨医科大学第二附属医院. 吉凯产品：Cas9&luciferase 慢病毒 |
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