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大家好，我是海明威，一个靠脸吃饭的男子，正好最近我听说很多童鞋中了基金，而且不知道该怎么花，如果你厌烦了测序芯片找lncRNA、circRNA→功能实验→分子机制，想试试一些新的课题思路，不妨看看此文。 最近我沉迷于CRISPR的海洋无法自拔，因为别人家的CRISPR为何总能发高分，而我们却只能用来做个基因敲除，灌水呢？我不服 CRISPR的基本作用除了基因敲入、基因敲除（Knockin、Knockout）外，还有基因干扰、基因激活、CRISPR高通量筛选（CRISPR/i、CRISPR/a、Screen）等，其在临床疾病上的科研应用非常广泛。 那么今天海明威就跟大家分享一下CRISPR能发高分的技术思路。 （一）新功能基因CRISPR高通量筛选 这样的工作量不小，但一般都是10分以上级别，当然也可以拆成几个低分的发一发。 进行全基因组功能基因筛选的一般流程可以归纳为 1.科学问题提出（例：耐药基因） ↓ 2.建立稳定的细胞模型 ↓ 3.购买或构建文库 ↓ 4.制备含有文库的细胞 ↓ 5.用文库细胞进行细胞模型实验 ↓ 6.细胞基因组提取，获得sgRNA序列 ↓ 7.测序获得初筛基因 ↓ 8.基因功能验证 文章举例： 【Cell】Genome-wideCRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis. 问题提出：发现肿瘤基因组中调控肿瘤生长、肿瘤转移的相关基因 细胞模型：非小细胞肺癌(NSCLC)(KrasG12D/ ;p53-/-;Dicer1 /-)；皮下注射（subcutaneoustransplant） 选择文库：mGeCKOa containing 67,405 sgRNAs（靶向20,611编码蛋白基因；1,175microRNA） 图：loss-of-function全基因组筛选肿瘤转移相关基因流程示意 图：验证候选基因流程示意及实验结果 （二）“阉割”的Cas9可做DNA抗体使用 将不具有核酸剪切活性的dCas9(deadCas9)与负责转录激活、转录抑制、表观调控和荧光表达等蛋白相融合，可以实现对靶基因的转录水平及表观遗传的调控，或对特定的DNA序列进行荧光成像和实时观察。 而这篇文章的作者，用“阉割”过的Cas9作为类似于抗体的特性，通过设计特异的sgRNA，将传统的金黄色葡萄球菌（MRSA）检测技术的时间大幅缩减到30分钟，灵敏度提高了5倍，经济成本居然还下降了，这样的创新无论哪个杂志都会喜欢的。 步骤如下： MRSA病原菌基因组信息设计sgRNA→裂解MRSA基因组成为裂解液→sgRNA、dCas9和病原体裂解液混合→通过Ni 磁珠吸附dCas9-sgRNA-dsDNA复合物→用Sybr Green I荧光测定dsDNA浓度 （三）2017国自然中CRISPR项目 来看一下今年的CRISPR基金情况。 部分基金的标题一览：
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